减少为了生产氨基酸或氨基酸衍生产物的亚胺/烯胺的积累制造技术

提供了微生物，该微生物被遗传修饰以过表达亚胺/烯胺脱氨酶以增强该微生物的赖氨酸和赖氨酸衍生物的生产。还提供了产生这种微生物的方法，以及使用该经遗传修饰的微生物生产赖氨酸和赖氨酸衍生物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】减少为了生产氨基酸或氨基酸衍生产物的亚胺/烯胺的积累
技术介绍
氨基酸(诸如赖氨酸)和氨基酸衍生产物(诸如尸胺)的过度生产通常需要对宿主细胞的代谢进行重塑以增加含碳和含氮化合物向所需产物的通量。然而，改变代谢途径的通量可导致通常不积累在细胞内的中间体的积累。这样的代谢中间体可以是酶反应的最终产物或从酶的催化位点泄漏的酶反应的中间体。积累的代谢中间体对细胞也可能是有毒的，或诱导将中间体转化成对细胞有毒的化合物的其他途径的活性(Danchin,MicrobialBiotechnology10:57-72,2017)。亚胺/烯胺中间体经常在导致反应性氨基酸衍生物(例如氨基丙烯酸酯或亚氨基丙酸)的形成的转氨、外消旋或脱氨反应期间形成。亚胺/烯胺形成有时涉及辅因子磷酸吡哆醛(PLP)。已知反应性亚胺/烯胺引起细胞损伤并且在氨基酸(诸如赖氨酸)和氨基酸衍生产物(诸如尸胺)的过度生产期间可能积累在细胞内。例如，大肠杆菌(Escherichiacoli)中赖氨酸或尸胺的过度生产可涉及以导致产生亚胺/烯胺化合物的方式对宿主代谢重塑。赖氨酸或尸胺的过度生产涉及编码以下一种或多种蛋白质的基因的过表达：二氢吡啶二羧酸合酶(DHDPS,EC4.2.1.52)、二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH,EC1.4.1.16)和二氨基庚二酸脱羧酶(DAPDC,EC4.1.1.20)(Anastassiadis,RecentPatentsonBiotechnology1:11-24,2007)。DHDPS催化丙酮酸和天冬氨酸半醛的缩合以形成4-羟基-2,3,4,5-四氢-L,L-吡啶二羧酸，其涉及亚胺中间体的形成(Dobsonetal.,ProteinScience17:2080-2090,2008)。DAPDH催化L-2-氨基-6-酮基庚二酸的还原胺化，产生被NADPH还原的亚胺中间体以产生内消旋DAP(Scapinetal.,Biochemistry37:3278-3285,1998)。DAPDC是PLP依赖性酶，其催化内消旋DAP脱羧为赖氨酸。某些DAPDC在PLP存在下形成醛亚胺(Huetal.,J.Biol.Chem.283:21284-21293,2008)。赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸共享相同的上游代谢途径，因为所有三个氨基酸均衍生自天冬氨酸。天冬氨酸转化为赖氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸的前体是由三种不同的天冬氨酸激酶催化的，一个激酶对应于一个氨基酸(LysC、MetL、ThrA)。然而，增加天冬氨酸生物合成的通量以增加赖氨酸或尸胺产生也将增加苏氨酸产生，因为它们共享共同的前体。苏氨酸在细胞中的积累可触发苏氨酸脱水酶(EC4.3.1.19)的活性，苏氨酸脱水酶是参与苏氨酸分解代谢为异亮氨酸的第一个酶。苏氨酸脱水酶是催化苏氨酸脱水为氨基巴豆酸酯(烯胺中间体)的PLP依赖性酶。氨基巴豆酸酯可以互变异构化为亚氨基丁酸酯(亚胺中间体)。因此，苏氨酸在细胞中的积累可增加这些有毒的烯胺/亚胺中间体在细胞内的积累。在某些情况下，减少或消除通过苏氨酸生物合成途径的通量以增加朝向赖氨酸和尸胺生物合成的含碳化合物和含氮化合物的通量。然而，需要将苏氨酸加入培养基中以确保苏氨酸的胞内浓度足以用于细胞生长。外部苏氨酸的添加可导致添加足够的苏氨酸，氨基酸在细胞内积累，在这种情况下，氨基巴豆酸酯和亚氨基丁酸酯的累积可如上所述产生。赖氨酸转化为尸胺涉及PLP依赖性酶赖氨酸脱羧酶。因此，尸胺的过度生产涉及增加PLP的胞内浓度，这可以通过将PLP加入到培养基中或者过表达参与PLP合成的基因(例如pdxST)来实现。如上所述，导致亚胺/烯胺积累的一些反应是PLP催化的反应。因此，PLP胞内浓度的增加使亚胺/烯胺在细胞内形成和积累的可能性增加。发现肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)产生具有亚胺/烯胺脱氨酶活性的蛋白RidA(YjgF)，从而允许其催化氨的释放和从亚胺/烯胺化合物生产更稳定且毒性较低的中间体(Lambrechtetal.,J.Biol.Chem.287:3454-3461,2012)。RidA通过催化氨从中间体烯胺/亚胺化合物中去除氨以形成无毒的2-酮丁酸来保护肠道沙门氏菌免受由PLP依赖性苏氨酸脱水酶(IlvA)的活性形成的有害亚胺/烯胺分子的影响。RidA的活性还显示保护细胞免受2-氨基丙烯酸酯(在丝氨酸分解代谢期间形成的烯胺)的影响(Lambrechtetal.,mBio4:1-8,2013)。亚胺/烯胺的积累还使细胞中的PLP催化的酶失活，因此去除亚胺/烯胺是重要的。
技术实现思路
本文提供了宿主细胞，该宿主细胞被遗传修饰以提高亚胺和烯胺化合物的去除并因此相对于不具有用以增加亚胺和/或烯胺去除的所述遗传修饰的相同菌株的宿主细胞，增加亚胺/烯胺为其中间体的氨基酸或氨基酸衍生物的产生。本文还提供了产生此类宿主细胞的方法；和使用所述宿主细胞来产生增加产率的氨基酸或氨基酸衍生物诸如赖氨酸或尸胺的方法。因此，在一个方面，本文提供了一种工程化宿主细胞以增加氨基酸或氨基酸衍生物(例如赖氨酸或尸胺)产生的方法，该方法包括将包含编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的核酸的多核苷酸(例如异源多核苷酸)引入宿主细胞中，其中所述宿主细胞具有至少一种另外的遗传修饰，与野生型宿主细胞相比，该另外的遗传修饰增加氨基酸或氨基酸衍生物的产生；在表达所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽的条件下培养所述宿主细胞，并选择相对于未修饰成表达编码所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽的所述多核苷酸的相同菌株的相对应宿主细胞，产生增加量的氨基酸或氨基酸衍生物(例如赖氨酸或尸胺)的宿主细胞。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YoaB多肽。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQIDNO:10具有至少70％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少80％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YjgH多肽。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQIDNO:12具有至少70％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQIDNO:12的氨基酸序列具有至少80％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQIDNO:12的氨基酸序列具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQIDNO:12的氨基酸序列具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含在引入到细胞中的表达载体中，其中所述表达载体包含可操作地连接到启动子的所述多核苷酸。在其它实施方案中，引入宿主细胞的所述多核苷酸被整合到宿主染色体中。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含外源多核苷酸的经遗传修饰的宿主细胞，所述外源多核苷酸包含编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的核酸，相对于未修饰成表达所述外源多核苷酸的相对应的宿主细胞，所述经遗传修饰的宿主细胞增加了氨基酸或氨基酸衍生物的量；并且与野生型宿主细胞相比，所述经遗传修饰的宿主细胞具有增加所述氨基酸或所述氨基酸衍生物生产的至少一种另外的遗传修饰。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含外源多核苷酸的经遗传修饰的宿主细胞，所述外源多核苷酸包含编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的核酸，相对于未修饰成表达所述外源多核苷酸的相对应的宿主细胞，所述经遗传修饰的宿主细胞增加了氨基酸或氨基酸衍生物的量；并且与野生型宿主细胞相比，所述经遗传修饰的宿主细胞具有增加所述氨基酸或所述氨基酸衍生物生产的至少一种另外的遗传修饰。


2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述氨基酸是赖氨酸并且所述氨基酸衍生物是尸胺。


3.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YoaB多肽。


4.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少80％的同一性，或至少90％的同一性。


5.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YjgH多肽。


6.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQIDNO:12的氨基酸序列具有至少80％的同一性，或至少90％的同一性。


7.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽包含SEQIDNO:10或SEQIDNO:12的氨基酸序列。


8.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽对所述宿主细胞是异源的。


9.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽包含对所述宿主细胞是天然的氨基酸序列。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述外源多核苷酸包含在引入到所述细胞中的表达载体中，其中所述表达载体包含可操作地连接到启动子的所述外源多核苷酸。


11.根据权利要求1-9中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述外源多核苷酸被整合到宿主染色体中。


12.根据权利要求1-11中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达外源赖氨酸脱羧酶多肽。


13.根据权利要求12所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述外源赖氨酸脱羧酶多肽是CadA多肽。


14.根据权利要求1-13中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达一种或多种外源赖氨酸生物合成多肽。


15.根据权利要求14所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述外源赖氨酸生物合成多肽是天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶。


16.根据权利要求15所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶是LysC、DapA、LysA、Asd、DapB或AspC多肽。


17.根据权利要求1-11中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达外源CadA、LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和AspC多肽。


18.根据权利要求1-17中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞属于埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒状杆菌属(Corynebacterium)。


19.根据权利要求18所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。


20.根据权利要求19所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。


21.一种工程化宿主细胞以增加氨基酸或氨基酸衍生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：周豪宏，陈玲，刘修才，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术股份有限公司，CIBT美国公司，
类型：发明
国别省市：上海;31