具有连续收获而无细胞排出的强化灌流细胞培养方法技术

本公开涉及用于培养细胞和收获生物制剂的方法和系统。更具体地，本公开涉及无细胞排出的强化灌流进行细胞培养和连续收获产品的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有连续收获而无细胞排出的强化灌流细胞培养方法【交叉引用】本申请要求于2018年11月2日提交的国际专利申请PCT/CN2018/113776和于2019年6月4日提交的国际专利申请PCT/CN2019/089993的优先权。两个申请的全部内容是通过引用并入本文。【专利
】本公开涉及用于培养细胞和收获生物制剂的方法和系统。更具体地，本公开涉及通过具有连续收获而无细胞排出的强化灌流进行细胞培养的方法。【专利技术背景】自1980年代开始从事生物制药生产以来，对大量治疗性重组蛋白的需求持续增长。开发用于生产重组蛋白或其他生物制品的生产工艺是一项复杂的工作，其中必须平衡许多变量。在典型的灌流工艺中，通过连续向细胞补充新鲜培养基并排出细胞以维持高细胞活力，可以长时间培养细胞。通常需要在连续生产中定期从生物反应器中排出细胞，这是比较低效的，因为这会导致细胞和目标生物产物的损失。在典型的细胞培养工艺中，由细胞分泌的生物产物在细胞培养期间被保留或收获，这取决于所使用的保留系统。在某些情况下，细胞和生物产物在培养工艺中保留在生物反应器中。例如，美国专利号9,469,865公开了一种灌流方法，其中将包含生物物质和细胞培养物的细胞培养物在分离系统上循环，其中将生物物质保留在反应器中或反馈到反应器中，并在培养终止时收获产物。收获时，超高的固含量导致很难澄清细胞和生物产物的混合物，并且收率超低。在某些其他情况下，细胞和生物产物在培养过程中从生物反应器中分离。仍需要改进细胞培养工艺，以提高产品产量，提高产品质量并降低成本。本公开通过提供用于通过连续灌流而没有细胞排出的强化灌流进行细胞培养的方法和系统来满足这些需求中的至少一个。【专利技术概述】本公开内容涉及通过在生物反应器中灌流培养细胞培养物来生产生物物质的方法，其中基础培养基(basalmedium)和补料培养基(feedmedium)以不同的速率补给到细胞培养物中，并且其中细胞培养物通过分离系统，不断收获生物物质。在培养工艺过程中，细胞会保留在生物反应器中而不会排出。就峰值活细胞密度和Qp(单位细胞产量)而言，本专利技术的方法提供了相当大的优势。结果，本方法可导致所需生物物质的生产率提高。已经发现，通过以不同的速率向细胞培养物中加入基础培养基和补料培养基，通过在培养期间改变温度，并且通过不排出细胞培养物，可以实现在早期阶段获得大量的生物质并在后期阶段获得高生产率。而且，连续收获生物物质的协调分离系统有助于实现高Qp，更好的生物物质质量和/或高纯化产率。本公开的方法被称为强化灌流培养(intensifiedperfusionculture，IPC)工艺，其中灌流工艺与连续收获工艺协调，并且培养过程中不用排出细胞。具体地，本公开提供了一种用于生产生物物质的方法，该方法包括：(a)培养包含细胞培养基和细胞的细胞培养物；(b)在生物反应器中以基础培养基和补料培养基灌流细胞培养物，和(c)收获生物物质，其中基础培养基和补给培养基以不同的速率补给到细胞培养物中，细胞培养物连续通过分离系统，并且在整个培养过程中将细胞保留在生物反应器中而不排出。在至少一个实施方式中，通过在生物反应器中接种表达目的生物物质的细胞来建立细胞培养物。在另一个实施方式中，通过在生物反应器中接种至少0.1×106个活细胞/mL来建立细胞培养物。在另一个实施方式中，通过接种约0.7～0.8×106个活细胞/mL，约0.8～1.0×106个活细胞/mL，约1.0～4.0×106个活细胞/mL来建立细胞培养物。在另一个实施方式中，通过接种约0.1～4.0×106个活细胞/mL、0.1～0.5×106个活细胞/mL，约0.5～1.0×106个活细胞/mL，约1.0～1.5×106个活细胞/mL，约1.5～2.0×106个活细胞/mL，约2.0～2.5×106个活细胞/mL，约2.5～3.0×106个活细胞/mL，约3.0～3.5×106个活细胞/mL约3.5～4.0×106个活细胞/mL，约0.2～0.4×106个活细胞/mL，约0.4～0.6×106个活细胞/mL，约0.6～0.8×106个活细胞/mL，约0.8～1.0×106个活细胞/mL，约1.0～1.2×106个活细胞/mL，约1.2～1.4×106个活细胞/mL，约1.4～1.6×106个活细胞/mL，约1.6～1.8×106个活细胞/mL约1.8～2.0×106个活细胞/mL来建立细胞培养物。通过以不同的速率灌流基础培养基和补料培养基来维持细胞培养物。在本公开的至少一个实施方式中，补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约0.1～20％，例如为基础培养基的灌流速率的约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％或约20％。根据细胞密度，活率和重量摩尔渗透压浓度调节补料培养基的灌流速率。在一些实施方式中，以不高于2.0VVD的灌流速率补给基础培养基，例如约0.1～不高于2.0VVD，约0.1～1.5VVD，约0.3～1.2VVD或约0.5～1.0VVD。在一些实施方式中，以不高于2.0VVD的灌流速率补给基础培养基，例如约0.1～2.0VVD，约0.1～0.3VVD，约0.3～0.6VVD，约0.6～0.9VVD，约0.9～1.2VVD，约1.2～1.5VVD，约1.5～1.8VVD，约1.8～2.0VVD或约0.5～1.0VVD，约0.7～1.2VVD，或约1.0～1.5VVD。在一些实施方式中，补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约1～15％，优选为约1～10％，更优选为约1～9％。在一些实施方式中，补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约1～15％，约1～14％，约1～13％，约1～12％，约1～11％，约1～10％，约1～9％，约1～8％，约1～7％，约1～6％，约1～5％，约1～4％，约1～3％，约1～2％，约2～9％，约3～9％，约4～9％，约5～9％，约6～9％或约7～9％。基础培养基的补给速率可以随着细胞密度的增加而增加，并且可以在细胞密度达到峰值之前达到目标补给速率(例如，在第3天到第6天)，然后目标补给速率可固定直到培养终止。在本公开的至少一个实施方式中，在培养工艺的第1、2、3、4、5、6、7或8天增加基础培养基的补给速率。补料培养基的补给速率可能会随着细胞密度的增加而增加，以提供足够的营养，通常从第2天到第4天开始，并且可能在第6天到第10天达到峰值，有时在细胞培养工艺中会随着细胞密度或活率下降而降低。在本公开的至少一个实施方式中，在培养工艺的第1、2、3、4、5、6、7或8天增加补料培养基的补给速率。在另一个实施方式中，补料培养基的补给速率在第3天，第4天，第5天，第6天，第7天，第8天，第9天，第10天，第11天，第12天，第13天或第14天达到峰值。在至少一个实施方式中，本公开的方法还包括使细胞培养物经历温度变化。温度变化的目的是在活细胞密度达到峰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生产生物物质的方法，其包括：/n(a)培养包含细胞培养基和细胞的细胞培养物，/n(b)在生物反应器中用基础培养基和补料培养基灌流细胞培养物，以及/n(c)收获生物物质，/n其中将基础培养基和补料培养基以不同的速率补给到细胞培养物中，使细胞培养物连续通过分离系统，并且将细胞保留在生物反应器中而不排出。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181102 CN PCT/CN2018/113776;20190604 CN PCT/CN201.生产生物物质的方法，其包括：
(a)培养包含细胞培养基和细胞的细胞培养物，
(b)在生物反应器中用基础培养基和补料培养基灌流细胞培养物，以及
(c)收获生物物质，
其中将基础培养基和补料培养基以不同的速率补给到细胞培养物中，使细胞培养物连续通过分离系统，并且将细胞保留在生物反应器中而不排出。


2.权利要求1的方法，其中所述分离系统是交替切向流过滤(ATF)装置或切向流过滤(TFF)装置。


3.权利要求1的方法，其中所述分离系统包括中空纤维过滤器。


4.权利要求3的方法，其中所述中空纤维过滤器的分子量截留值(MWCO)大于所述生物物质的分子量。


5.权利要求4的方法，其中所述中空纤维过滤器的孔径为约0.08μm～约0.5μm。


6.权利要求4的方法，其中所述中空纤维过滤器的孔径为约0.1μm～约0.5μm。


7.权利要求4的方法，其中所述孔径为约0.2μm或约0.45μm。


8.权利要求1～7任一项的方法，其中所述基础培养基以每天约0.1～不高于约2.0工作体积(VVD)的灌流速率补给。


9.权利要求1～7任一项的方法，其中所述基础培养基以约0.1～约1.5(VVD)的灌流速率补给。


10.权利要求1～7任一项的方法，其中所述基础培养基以约0.3～约1.2(VVD)的灌流速率补给。


11.权利要求1～7任一项的方法，其中所述基础培养基以约0.5～约1.0(VVD)的灌流速率补给。


12.权利要求1～7任一项的方法，其中所述补料培养基的灌流的速率为基础培养基的灌流速率的约0.1％～约20％。


13.权利要求1～7任一项的方法，其中所述补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约1％～约15％。


14.权利要求1～7任一项的方法，其中所述补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约1％～约10％。


15.权利要求1～7任一项的方法，其中所述补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约1％～约9％。


16.权利要求1～15任一项的方法，其中所述细胞在约35℃～约37℃的范围内培养。


17.权利要求1～16任一项的方法，其还包括使所述细胞培养物经历温度转变至约28℃～约33℃范围内的温度。


18.权利要求1～17任一项的方法，其中所述温度转变是响应于预定的峰值活细胞密度(活细胞密度)。


19.权利要求1～18任一项的方法，其中在达到峰值活细胞密度之前降低温度。


20.权利要求1～19任一项的方法，其中将消泡剂添加到所述生物反应器中。


21.权利要求20的方法，其中所述消泡剂选自：油基消泡剂，粉末消泡剂，水基消泡剂，硅氧烷基消泡剂，EO/PO基消泡剂，聚丙烯酸酯烷基酯及其任意组合。


22.权利要求1～21任一项的方法，其中使用微泡通气装置。


23.权利要求22的方法，其中所述微泡通气装置以在约0.2～约0.5VV...

【专利技术属性】
技术研发人员：周伟昌，周航，方明月，唐思远，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31