细胞层叠体的制造方法技术

本发明专利技术涉及一种细胞层叠体的制造方法，其使用具有底部及从底部的外缘立起的侧壁部的容器、多孔膜、在与容器的内底面不接触的位置对置于内底面保持多孔膜的保持部件来制造在多孔膜的两面具备细胞层的细胞层叠体，该细胞层叠体的制造方法包括：多孔膜由保持部件保持为在与容器的内底面不接触的位置对置于内底面的状态，而且在重力方向上容器的底部在上方且多孔膜在下方的状态下，在与容器的内底面和多孔膜表面接触的液体培养基中培养第一细胞；及多孔膜由保持部件保持为在与容器的内底面不接触的位置对置于内底面的状态，而且在重力方向上容器的底部在下方且多孔膜在上方的状态下，在多孔膜的下侧表面上培养第一细胞，在多孔膜的上侧表面上培养第二细胞。

Manufacturing method of cell stack

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞层叠体的制造方法
本专利技术涉及一种细胞层叠体的制造方法。
技术介绍
制造具有与活体内组织类似的结构的人工细胞组织的方法，例如在日本特开2002-335949号公报及日本专利第5113332号公报中公开。在日本特开2002-335949号公报中公开了：在蜂窝结构体薄膜的两面培养细胞，得到了细胞的三维聚集体。即，在专利文献1中公开了：在蜂窝结构体薄膜的一个表面接种细胞并使其粘附于薄膜，接着，在另一表面接种细胞，在薄膜的两面培养了相同种类的细胞(肝细胞或心肌细胞)。在日本专利第5113332号公报中公开了一种血脑屏障模型，其在被称为细胞培养插入物(cellcultureinsert)的过滤器器件的过滤器上表面配置了脑毛細血管内皮细胞层，在过滤器下表面配置了脑周细胞层，在培养板的底面配置了星形胶质细胞层。在本专利技术中，在将细胞培养插入物上下倒置的状态下，在过滤器上接种脑周细胞而进行培养之后，将细胞培养插入物设置于培养板内，并在细胞培养插入物内侧接种血管内皮细胞，由此在过滤器的两面形成有细胞层。
技术实现思路
专利技术要解决的技术课题为了得到替代动物实验的药物评价用或病情评价用的人工细胞组织，需要构建具有与活体内组织近似的结构及功能的细胞组织。从构建具有与活体内组织近似的结构及功能的细胞组织的观点出发，期望如专利文献1中的蜂窝结构体薄膜那样将开口率高的多孔膜设为细胞培养的脚手架，并在多孔膜的两面培养细胞。并且，也要求构建一种细胞层叠体，其根据人工细胞组织所模拟的活体组织，在多孔膜的两面分别培养不同种类的细胞，细胞的种类在两个细胞层中不同。然而，在专利文献1中未具体地公开在蜂窝结构体薄膜的两面分别培养不同种类的细胞的方法。另一方面，在专利文献2中公开了：在细胞培养插入物的过滤器的上表面及下表面分别培养不同种类的细胞的方法。然而，在该培养方法中使用的细胞培养插入物是Transwell(注册商标)插入物，该过滤器是径迹蚀刻膜(tracketchedmembrane、TE膜)。TE膜通常开口率低(2％～20％左右)，因此即使在TE膜上放置细胞悬浮液，液体培养基也不易通过TE膜而落下。从而，若是将具备TE膜作为过滤器的细胞培养插入物，则能够在上下倒置的状态下在过滤器上接种细胞悬浮液而进行细胞培养。然而，在细胞培养插入物的过滤器中适用了如专利文献1中的蜂窝结构体薄膜那样开口率高的多孔膜的情况下，若在上下倒置的状态下在过滤器上接种细胞悬浮液，则导致液体培养基通过多孔膜的孔而落下，因此无法进行细胞培养。本专利技术的实施方式根据上述情况而完成。本专利技术的目的在于提供一种新型细胞层叠体的制造方法，并解决该问题作为课题。用于解决技术课题的手段用于解决上述课题的具体方法中包括以下方式。[1]一种细胞层叠体的制造方法，其使用具有底部及从底部的外缘立起的侧壁部的容器、多孔膜、在与容器的内底面不接触的位置对置于内底面保持多孔膜的保持部件来制造在多孔膜的两面具备细胞层的细胞层叠体，该细胞层叠体的制造方法包括：多孔膜由保持部件保持为在与容器的内底面不接触的位置对置于内底面的状态，而且在重力方向上容器的底部在上方且多孔膜在下方的状态下，在与容器的内底面和多孔膜表面接触的液体培养基中培养第一细胞；及多孔膜由保持部件保持为在与容器的内底面不接触的位置对置于内底面的状态，而且在重力方向上容器的底部在下方且多孔膜在上方的状态下，在多孔膜的下侧表面上培养第一细胞，在多孔膜的上侧表面上培养第二细胞。[2]根据[1]所述的细胞层叠体的制造方法，其中，在容器的内底面具有第一细胞不粘附的性质。[3]根据[1]或[2]所述的细胞层叠体的制造方法，其中，保持部件具备：筒状部，其为在轴向的一端保持所述多孔膜的筒状部，并具有比容器的内径更小的外径，轴向的长度比容器的侧壁部的高度更短；及突出部，从筒状部的轴向的另一端向径向外侧突出，并悬挂在容器的所述侧壁部的边缘。[4]根据[1]至[3]中任一项所述的细胞层叠体的制造方法，其中，多孔膜为具有蜂窝结构的多孔膜。[5]根据[1]至[4]中任一项所述的细胞层叠体的制造方法，其中，多孔膜的材质为选自包括聚丁二烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乳酸及聚乳酸-聚乙醇酸共聚物的组中的至少一种。[6]根据[1]至[5]中任一项所述的细胞层叠体的制造方法，其中，多孔膜中至少培养细胞的表面由选自包括纤连蛋白、胶原蛋白、层粘蛋白、玻连蛋白、明胶、基底膜蛋白聚糖、巢蛋白、蛋白聚糖、骨桥蛋白、腱生蛋白、肾连蛋白、基底膜基质及聚赖氨酸的组中的至少一种包覆。[7]根据[1]至[6]中任一项所述的细胞层叠体的制造方法，其中，第一细胞和第二细胞是不同种类的细胞，第一细胞和第二细胞两种细胞是选自包括实质细胞、间质细胞、肌细胞、成纤维细胞、神经细胞、内皮细胞、上皮细胞及分化为它们中的任一个的细胞的组中的两种细胞。[8]根据[1]至[7]中任一项所述的细胞层叠体的制造方法，其中，第一细胞是平滑肌细胞或分化为平滑肌细胞的细胞，第二细胞是血管内皮细胞或分化为血管内皮细胞的细胞。专利技术效果根据本专利技术，提供一种新型细胞层叠体的制造方法。附图说明图1A是表示具有蜂窝结构的多孔膜的一例的立体图。图1B是从上表面侧观察了图1A中的多孔膜的俯视图。图1C是沿图1B中的多孔膜的c-c线的剖视图。图2A是表示保持部件的一例的立体图。图2B是表示将图2A中所示出的保持部件设置在培养容器中的状态的立体图。图3是表示本专利技术的制造方法的一例的示意图。图4是表示本专利技术的制造方法的一例的示意图。图5是在实施例1中使用的多孔膜的显微镜图像。图6是实施例1中的在多孔膜的两面形成的细胞层各自的荧光免疫染色图像。图7是表示FITC-葡聚糖70的相对荧光强度的图。图8是实施例2中的在多孔膜的两面形成的细胞层各自的荧光免疫染色图像。图9是实施例2中的细胞层叠体的荧光免疫染色图像。具体实施方式以下，对本专利技术的实施方式进行说明。这些说明及实施例例示出实施方式，但并不限制本专利技术的范围。本专利技术中描述的作用机理包括推定，其正确与否并不限制本专利技术的范围。在本专利技术中，使用“～”示出的数值范围表示将记载于“～”前后的数值分别作为下限值及上限值而包括的范围。在本专利技术中提及组合物中的各成分的量的情况下，在组合物中存在多种相当于各成分的物质的情况下，除非另有说明，是指在组合物中存在的该多种物质的总量。＜细胞层叠体的制造方法＞本专利技术的细胞层叠体的制造方法是如下方法，即，在多孔膜的两面培养细胞而在多孔膜的两面形成细胞层，由此制造在多孔膜的两面具备细胞层的细胞层叠体的方法。本专利技术的细胞层叠体的制造方法使用具有底部及从底部的外缘立起的侧壁部的容器、多孔膜、在与容器的内底面不接触的位置对置于内底面保持多孔膜的保持部件。以下，将上述容器称为“培养容器”。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞层叠体的制造方法，其使用具有底部及从所述底部的外缘立起的侧壁部的容器、多孔膜、和在与所述容器的内底面不接触的位置对置于该内底面地保持所述多孔膜的保持部件来制造在所述多孔膜的两面具备细胞层的细胞层叠体，所述细胞层叠体的制造方法包括：/n所述多孔膜由所述保持部件保持为在与所述容器的内底面不接触的位置对置于该内底面的状态，而且在重力方向上所述容器的所述底部在上方且所述多孔膜在下方的状态下，在与所述容器的内底面和所述多孔膜表面接触的液体培养基中培养第一细胞；及/n所述多孔膜由所述保持部件保持为在与所述容器的内底面不接触的位置对置于该内底面的状态，而且在重力方向上所述容器的所述底部在下方且所述多孔膜在上方的状态下，在所述多孔膜的下侧表面上培养所述第一细胞，在所述多孔膜的上侧表面上培养第二细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170609 JP 2017-1147551.一种细胞层叠体的制造方法，其使用具有底部及从所述底部的外缘立起的侧壁部的容器、多孔膜、和在与所述容器的内底面不接触的位置对置于该内底面地保持所述多孔膜的保持部件来制造在所述多孔膜的两面具备细胞层的细胞层叠体，所述细胞层叠体的制造方法包括：
所述多孔膜由所述保持部件保持为在与所述容器的内底面不接触的位置对置于该内底面的状态，而且在重力方向上所述容器的所述底部在上方且所述多孔膜在下方的状态下，在与所述容器的内底面和所述多孔膜表面接触的液体培养基中培养第一细胞；及
所述多孔膜由所述保持部件保持为在与所述容器的内底面不接触的位置对置于该内底面的状态，而且在重力方向上所述容器的所述底部在下方且所述多孔膜在上方的状态下，在所述多孔膜的下侧表面上培养所述第一细胞，在所述多孔膜的上侧表面上培养第二细胞。


2.根据权利要求1所述的细胞层叠体的制造方法，其中，
所述容器的内底面具有所述第一细胞不粘附的性质。


3.根据权利要求1或2所述的细胞层叠体的制造方法，其中，
所述保持部件具备：
筒状部，其为在轴向的一端保持所述多孔膜的筒状部，并具有比所述容器的内径小的外径，轴向的长度比所述容器的所述侧壁部的高度短；及
突出部...

【专利技术属性】
技术研发人员：西野雅史，伊藤晃寿，美马伸治，三好隼人，
申请(专利权)人：富士胶片株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP