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一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法技术

技术编号:24882250 阅读:18 留言:0更新日期:2020-07-14 18:08
本发明专利技术公开了一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法,属于遗传工程领域。本发明专利技术通过将N‑乙酰神经氨酸合酶和N‑乙酰神经氨酸醛缩酶同时整合到基因组上表达,并选取3个不同强度启动子对NeuB和NanA基因进行表达量优化,最终产量在摇瓶中达到了8.3g/L,为进一步提高枯草芽孢杆菌N‑乙酰神经氨酸产量奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法
本专利技术涉及一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法,属于遗传工程领域。
技术介绍
N-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖,广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中,N-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此,N-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力,促进婴儿大脑发育。目前,N-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等),存在其他产物难以分离,且成本较高;另外可以通过全细胞转化的方法获得,但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物,由于底物转化率较低,导致神经氨酸生产成本较高。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主,其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主,通过代谢工程改造,以葡萄糖等廉价碳源为底物,高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。目前在枯草中构建的N-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过N-乙酰氨基葡萄糖为前体的NeuB关键酶合成途径,由于枯草芽孢杆菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸(NeuB合成神经氨酸的前体物质)浓度较低,限制了神经氨酸的合成效率。这个问题的存在严重限制了神经氨酸产量的提高,进一步限制了其市场应用。
技术实现思路
为解决上述问题,本申请在强化NeuB为特征酶的途径基础上,进一步引入N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA),其以丙酮酸为前体物质,并选取3个不同强度启动子优化NeuB和NanA表达水平,以获得N-乙酰神经氨酸产量提高的菌株。本专利技术的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌,通过不同强度的启动子整合表达了N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA),所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.3~5任一所示。在一种实施方式中,N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在一种实施方式中,N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。在一种实施方式中,P1启动子核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。在一种实施方式中,P2启动子核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。在一种实施方式中,P3启动子核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。在一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌还过表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)。在一种实施方式中,所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示;所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。在一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌是以P1启动子表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶,并以P2启动子表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶。在一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌是以P1启动子表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶,并以P2启动子表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶,并以P1启动子表达N-乙酰神经氨酸合酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶。在一种实施方式中,所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌BSGN6-comK;所述枯草芽孢杆菌BSGN6-comK的构建方法公开于论文《Modularpathwayengineeringofkeycarbon-precursorsupply-pathwaysforimprovedN-acetylneuraminicacidproductioninBacillussubtilis》中。本专利技术的第二个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法,是分别构建氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶基因、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合酶基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因的重组整合片段,再将一个或多个重组整合片段转化至枯草芽孢杆菌基因组上;所述重组整合片段是由基因左臂、启动子片段、基因片段和基因右臂按顺序融合连接而成。在本专利技术的一种实施方式中,所述启动子片段的核苷酸序列选自SEQIDNO.9~11。在本专利技术的一种实施方式中,所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌BSGN6-comK为宿主。本专利技术的第三个目是提供一种提高枯草芽孢杆菌神经氨酸产量的方法,是通过强启动子强化N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)的表达。在一种实施方式中,所述方法还强化氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达。在一种实施方式中,所述强启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.10或SEQIDNO.11所示。本专利技术的第四个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌在生产神经氨酸及其衍生产品方面的应用。在一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌接种在LB培养基中,培养12~18h获得OD为6~10的种子液,再以1~10%的接种量转接至发酵培养基中进行发酵。在一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌的培养条件为在30~37℃培养16~72h。有益效果:(1)本专利技术通过以3个不同强度启动子(P1、P2和P3)优化N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)在基因组上的表达水平,降低了关键酶对细胞造成的蛋白合成压力,并进一步将优化表达水平的N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)整合到同一株重组枯草芽孢杆菌中,使枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸产量由2.75g/L提高至9.5g/L以上;(2)本专利技术提供多途径构建策略,构建方法简单,便于使用,具有很好的代谢工程应用前景。具体实施方式Neisseriameningitidis来源的N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)酶氨基酸列如SEQIDNO.1所示,核苷酸序列如SEQIDNO.2所示;氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)氨基酸列如SEQIDNO.3所示,核苷酸序列如SEQIDNO.4所示;N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)氨基酸序列如SEQIDNO.5所示,核苷酸序列如SEQIDNO.6所示;N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)氨基酸序列如SEQIDNO.7所示,核苷酸序列如SEQIDNO.8所示;P1启动子核苷酸序列如SEQIDNO.9所示;P2启动子核苷酸序列如SEQIDNO.10所示;P3启动子核苷酸序列如SEQIDNO.11所示;大肠杆菌来源NeuB酶氨基酸列如SEQIDNO.12所示,核苷酸序列如SEQIDNO.13所示;Moritellaviscosa来源NeuB酶氨基酸列如SEQIDNO.14所示,核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。发酵培养基(g/L):葡萄糖60,胰蛋白胨6,酵母粉12,硫酸铵6,磷酸氢二钾12.5,磷酸二氢钾2.5,硫酸镁3。N-乙酰神经氨酸检测方法:Agil本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,通过不同强度的启动子整合表达N-乙酰神经氨酸合酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶,所述启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.9~11。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,通过不同强度的启动子整合表达N-乙酰神经氨酸合酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶,所述启动子的核苷酸序列选自SEQIDNO.9~11。


2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述N-乙酰神经氨酸合酶来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)。


3.根据权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,还强化表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶。


4.根据权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述重组枯草芽孢杆菌是以SEQIDNO.9所示的启动子调控氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达,并以SEQIDNO.10所示的启动子表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶。


5.根据权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述重组枯草芽孢杆菌中氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶、N-乙酰神经氨酸合酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶分别通过SEQIDNO.9所示的启动子调控表达,N-乙酰氨基葡萄糖异构酶通过SEQIDNO.10所示的启动子调控表达。


6.根据权利要求1~5任一所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘延峰刘龙张晓龙堵国成李江华陈坚
申请(专利权)人:江南大学
类型:发明
国别省市:江苏;32

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