用于检测铜绿假单胞菌19个血清型的液相芯片及应用制造技术

本发明专利技术提供了用于检测铜绿假单胞菌O抗原共19个血清型的特异寡核苷酸序列，连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，该寡核苷酸包括：（1）铜绿假单胞菌O抗原1‑5型、7‑14型、16型、18‑20型的

【技术实现步骤摘要】
用于检测铜绿假单胞菌19个血清型的液相芯片及应用
本专利技术属于细菌检测方法
，涉及用于铜绿假单胞菌19个血清型分型的液相芯片及应用。
技术介绍
铜绿假单胞菌是一种重要的革兰氏阴性条件致病菌，是医院内感染的重要病原菌之一。特别是接受免疫抑制治疗（如癌症治疗）、烧伤治疗，以及HIV患者和囊性纤维化患者，更易受到铜绿假单胞菌的感染。此外，近年来随着临床上多重耐药铜绿假单胞菌菌株的不断增加，使得临床用药和治疗更加困难，其结果是由耐药性铜绿假单胞菌导致感染的发病率和死亡率的增加。目前，国内大多医院采用传统技术检测病原微生物（包括铜绿假单胞菌在内），即对细菌进行培养和单菌落分离后，进行生化指标的检测，或通过免疫学鉴定（免疫荧光、免疫电镜、血细胞凝集试验等）等方法做出诊断。该方法具有较好的特异性，但是往往灵敏度较低、检测用时长。血清学检测方法具有操作简便和结果判读直观的特点，自上世纪30年代以来被广泛应用，被认为具有最好的特异性和灵敏性，该方法可有效区分一个种/属中不同致病性的菌株。目前，大多数重要致病菌都建立了基于表面多糖抗原的血清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸序列包括下述DNA片段：/n（1）铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的

【技术特征摘要】
1.连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸序列包括下述DNA片段：
（1）铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的wzy基因中选取的一种DNA片段；
（2）铜绿假单胞菌O抗原6型的wbpP基因中选取的一种DNA片段；
（3）铜绿假单胞菌O抗原17型的插入序列IS中选取的一种DNA片段
（4）铜绿假单胞菌O抗原2型和6型wzyβ基因中选取的一种DNA片段
上述的寡核苷酸DNA片段为SEQIDNO:1-14所示的核苷酸序列如下：
SEQID(5'-3')
NO:1GGCTTATGCCGGTGGTAA用于检测铜绿假单胞菌O抗原1型
NO:2GCAGTCCCTGCTAACTGTA用于检测铜绿假单胞菌O抗原2/5/16/18/20型
NO:3TTGCTGCTTTCGGTTGTT用于检测铜绿假单胞菌O抗原2/16型
NO:4GGGCTCTATCAGGAACTCTTACT用于检测铜绿假单胞菌O抗原3型
NO:5TTTTGGATTTTCTGCCGGGGCG用于检测铜绿假单胞菌O抗原4型
NO:6TGCTGATTGCAGCCAGAG用于检测铜绿假单胞菌O抗原6型
NO:7ATATTTTATTCTCGTGGGGTTCT用于检测铜绿假单胞菌O抗原7/8型
NO:8GGATACCCGGTCACGCT用于检测铜绿假单胞菌O抗原9型
NO:9TTTGATGATAAATCGGCTCA用于检测铜绿假单胞菌O抗原10/19型
NO:10CACATGCAAGTGCTCGTT用于检测铜绿假单胞菌O抗原11型
NO:11TGGGATACCTTCTCCTGAC用于检测铜绿假单胞菌O抗原12型
NO:12CATGTTGGGTTTTTTGATT用于检测铜绿假单胞菌O抗原13型
NO:13CACGTTGGGTTTTTGATT用于检测铜绿假单胞菌O抗原14型
NO:14CTCTCGTCCTTGGTCGTA用于检测铜绿假单胞菌O抗原17型。


2.权利要求1所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针在制备用于检测铜绿假单胞菌O抗原19个血清型中至少一种血清型方面的应用。


3.权利要求1所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针悬液芯片的制备方法，主要包含以下步骤：
（1）在铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的wzy基因内部，O抗原6型的wbpP基因，O抗原17型的插入序列IS内部，以及O抗原2型和6型wzyβ基因内部设计并制备用于多重PCR的DNA引物，每个血清型的引物包含上、下游引物各1对，且下游引物利用生物素基团进行标记；
（2）在铜绿假单胞菌O抗原1-5型、7-14型、16型、18-20型的wzy基因内部，O抗原6型的wbpP基因，O抗原17型的插入序列IS内部，以及O抗原2型和6型wzyβ基因内部设计并制备用DNA探针，每个血清型的探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条DNA探针在5'末端均加入15个胸腺嘧啶核苷酸（dT）作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的磁性微球进行偶联；
（3）利用步骤（2）特异探针与不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针微球的偶联；
（4）制备待检测样品的基因组DNA，利用步骤（1）制备的引物，进行多重PCR扩增；
（5）利用步骤（4）获得扩增产物与步骤（3）获得的偶联微球的探针进行杂交和染色；
（6）将步骤（5）获得的染色后的杂交产物利用Bio-Plex200悬液芯片系统进行检测；
其中，步骤（1）所述的引物包括SEQIDNO:15-42所示的核苷酸序列，各条序列(5'-3')如下：
P1（SEQIDNO:15）TAGGTAGTTCTGGCGGTGTAG扩增铜绿假单胞菌O抗原1型wzy基因的上游引物；
P2（SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭玺，许琮，刘斌，李慧颖，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12