一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，首先提取乳品样本，提取乳品样本多的RNA；在0.5ml微量离心管中，加入步骤一中RNA1‑5μg，补充DEPCH

【技术实现步骤摘要】
一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法
本专利技术涉及一种乳品检测方法，特别涉及一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，属于乳品检测

技术介绍
近年来，随着PCR技术的发展，针对某一种或一类致病菌的PCR检验方法被建立起来，得到了广泛应用。在食品安全检测领域，基于DNA扩增的PCR检测病原菌方法，检测时间为两天左右，并且检测结果若为阳性不能说明检出的致病菌为死菌还是活菌，还需进一步送实验室按照国标方法进行细菌培养才能够发检验报告。目前奶制品厂使用的方法仍然是直接细菌培养方法，需要4-5天时间才能发报告，导致大量产品要在仓库放置几天才能够出厂销售，造成生产厂家的生产成本增加。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法：(1)首先提取乳品样本，提取乳品样本多的RNA；(2)在0.5ml微量离心管中，加入步骤一中RNA1-5μg，补充DEPCH2O使总体积达11ul，在管中加10μMOligo(dt)12-18ul,然后均匀摇晃进行离心；(3)70℃加热10分钟后，立即将步骤2中的微量离心管插入冰浴中1分钟；(4)取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2ul；上游引物(10pM)2ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，轻轻混匀，离心，42℃孵育2～5min；(5)将管插入冰中，加入RNaseH1，37℃孵育20min，降解残留的RNA，-20℃保存备用；(6)取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2ul；上游引物(10pM)ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，加入适量的ddH2O，使总体积达50ul，轻轻混匀，离心；(7)设定RT-PCR程序，在适当的温度参数下扩增28～32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在RT-PCR扩增目的基因时，加入一对内参的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；(8)在反应管中加有石蜡油，需用100ul氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油或者直接取5-10ul电泳检测。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述的PCRbuffer使用之间加44mL无水乙醇。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述的引物扩增的效率和种属特异性，扩增的片段不能太长，引物的Tm值要接近，适合PCR扩增条件的优化。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述的TaqDNA聚合酶在反应体系中，加入2-4ul的酶量，能够达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述的PCR试剂配制应使用最高质量的双蒸水，采用0.22um滤膜过滤除菌或高压灭菌。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，mRNA作为检测的靶基因，可以通过PCR等方法检出，而mRNA在细菌死亡后能够快速降解，因此选择适当的mRNA作为靶点基因，便能够只检测到具有活性的细菌，避免死亡细菌造成的假阳性干扰；同时项目通过对PCR引物的改进设计，运用实时荧光RT-PCR技术，可以实现对多种细菌的联合检测，更加节省时间和成本。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术的技术方案进行详细的说明，但是本专利技术的范围不受这些实施例的限制。本专利技术提供了一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，其步骤如下：(1)首先提取乳品样本，提取乳品样本多的RNA；(2)在0.5ml微量离心管中，加入步骤一中RNA1-5μg，补充DEPCH2O使总体积达11ul，在管中加10μMOligo(dt)12-18ul,然后均匀摇晃进行离心；(3)70℃加热10分钟后，立即将步骤2中的微量离心管插入冰浴中1分钟；(4)取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2ul；上游引物(10pM)2ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，轻轻混匀，离心，42℃孵育2～5min；(5)将管插入冰中，加入RNaseH1，37℃孵育20min，降解残留的RNA，-20℃保存备用；(6)取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2ul；上游引物(10pM)ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，加入适量的ddH2O，使总体积达50ul，轻轻混匀，离心；(7)设定RT-PCR程序，在适当的温度参数下扩增28～32个循环，为了保证实验结果的可靠与准确，可在RT-PCR扩增目的基因时，加入一对内参的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；(8)在反应管中加有石蜡油，需用100ul氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油或者直接取5-10ul电泳检测。其中，的PCRbuffer使用之间加44mL无水乙醇，的引物扩增的效率和种属特异性，扩增的片段不能太长，引物的Tm值要接近，适合PCR扩增条件的优化。进一步地，的TaqDNA聚合酶在反应体系中，加入2-4ul的酶量，能够达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。更进一步地，的PCR试剂配制应使用最高质量的双蒸水，采用0.22um滤膜过滤除菌或高压灭菌。“包含”和“包括”当用于本说明书中时被认为是指存在所陈述的特征、整体、步骤或部分，但不排除存在或添加一种或多种其他特征、整体、步骤、部分或其组合。因此，除非上下文另外明确要求，在整个所述描述和权利要求书中，单词包含”和“包括”等应以包括性意义解释而不是排他或穷尽的意义；就是说，以“包括但不限于”的意义。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，其步骤如下：/n(1)首先提取乳品样本，提取乳品样本多的RNA；/n(2)在0.5ml微量离心管中，加入步骤一中RNA1-5μg，补充DEPCH

【技术特征摘要】
1.一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，其步骤如下：
(1)首先提取乳品样本，提取乳品样本多的RNA；
(2)在0.5ml微量离心管中，加入步骤一中RNA1-5μg，补充DEPCH2O使总体积达11ul，在管中加10μMOligo(dt)12-18ul,然后均匀摇晃进行离心；
(3)70℃加热10分钟后，立即将步骤2中的微量离心管插入冰浴中1分钟；
(4)取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2ul；上游引物(10pM)2ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，轻轻混匀，离心，42℃孵育2～5min；
(5)将管插入冰中，加入RNaseH1，37℃孵育20min，降解残留的RNA，-20℃保存备用；
(6)取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2ul；上游引物(10pM)ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，加入适量的ddH2O，使总体积达50ul，轻轻混匀，离心；
(7)设定...

【专利技术属性】
技术研发人员：高安成，胡军，杨晓东，李宏铎，李亚楠，沙淼，
申请(专利权)人：西安市食品药品检验所，陕西瑞奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61