基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒及使用方法技术

基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒及使用方法，包含12种常见寄主动物Cytb基因的特异性扩增引物以及基因组DNA。该试剂盒使用方法为提取吸血蠓饱血腹部的血液基因组DNA，利用特异性引物进行PCR扩增，再根据PCR扩增产物大小来鉴定出对应的寄主。本申请提供扩增12种常见寄主动物Cytb基因的扩增引物及寄主鉴定方法，有利于实现吸血蠓常见寄主生物准确、快速的鉴定，降低物种鉴定成本。

【技术实现步骤摘要】
基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒及使用方法
本专利技术涉及一种基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒及使用方法，属于吸血蠓类寄主动物的物种鉴定领域。
技术介绍
蠓科Ceratopogonidae昆虫隶属于双翅目Diptera长角亚目Nematocera，是长角亚目中最大的一个类群，我国现知37属1176种。吸血蠓(Bloodsuckingmidges)是蠓科昆虫中能叮咬人和动物并吸食其血液的类群总称，全世界共有4属1487种，广泛分布，我国仅有库蠓属Culicoidess、蠛蠓属Lasiohelea及细蠓属Leptoconops三属吸血蠓。蠓类雄性以花蜜为食，而雌性需吸食血液后卵子才能发育成熟。雌蠓叮咬会造成严重的皮肤损伤，发生皮炎，影响家畜和野生动物的一般健康状况。不仅如此，吸血蠓还会携带病原体并传播给人类、牲畜和野生动物等，在虫媒病的传播中发挥着重要作用。迄今，已从库蠓中分离鉴定出多达35种病毒，其中包括环状病毒(Orbivirus)、水泡性病毒(Vesiculovirus)、暂时热病毒(Ephemerovirus)、正布尼亚病毒(Orthobunyavirus)等。因此，准确鉴定吸血蠓类昆虫的寄主偏好，掌握传播媒介吸血习性是对蠓传疾病进行监测、防治的关键。目前，免疫法和分子测序法是检测吸血蠓寄主的主要方法。免疫法是利用免疫学的方法来鉴定吸血蠓的寄主，但此类方法存在试剂昂贵、步骤复杂繁琐、检测范围有限、容易出现交叉反应导致物种鉴定错误等缺陷。分子测序法是利用通用引物对不同动物的特定基因序列进行PCR扩增，测序后经过数据库比对来鉴定吸血蠓的寄主，但这类方法所用到测序技术产生的经济成本较高，限制了较大样本的鉴定。因此，急需一种准确、快速、简便且检测成本较低的方法，来弥补传统方法的不足。随着分子生物学的发展，分子检测技术也有了进一步的提升。线粒体DNA基因组具有分子结构简单、无重组、进化速率快、严格的母系遗传等特点，比核DNA更容易检测到，并且在物种内不同个体之间只有1％-2％的差异，而在不同物种之间差异较大。能够将亲缘关系相近或相关的物种区分或鉴定出来。Cytb基因与线粒体其他基因相比，具有较为保守的结构和大小，包含大量的遗传信息，由于其独具的优势而被广泛的研究应用。本专利技术提供了12种常见寄主生物(人，牛，羊，鸭，狗，猪，鼠，马，兔，猫，鹿以及鸡)的Cytb基因特异引物及寄主鉴定方法，有利于实现对上述寄主的快速、准确鉴定，缩短鉴定时间，降低物种鉴定成本。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒。通过提取吸血蠓腹部血粉DNA，利用不同物种的特异引物PCR扩增其Cytb基因，比对PCR产物条带大小，实现吸血蠓寄主准确且快速的鉴定。为实现上述目标，所采用的技术方案如下：基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒，所述试剂盒中含有12种常见寄主动物Cytb基因特异性扩增的PCR引物，引物序列及其扩增片段长度如下：a、人的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TCTCCGATCCGTCCCTAACA3’；下游引物：5’GTGATTGGCTTAGTGGGCGA3’；扩增片段长度为：131bp；b、牛的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACACGCAAACGGAGCTTCA3’；下游引物：5’TAGGCATTGGCTGAGTGGTC3’；扩增片段长度为：728bp；c、羊的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGCGCCATGCTACTAATTCTTG3’；下游引物：5’GATGTTCGACTGGCTGTCCT3’；扩增片段长度为：346bp；d、鸭的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ACATCGGACAGACCCTGGTA3’；下游引物：5’AGAAGTAGGGGTGGAATGGGA3’；扩增片段长度为：210bp；e、狗的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACATCGGACACAGCCACAG3’；下游引物：5’AGCTGCGATGATGAAAGGGA3’；扩增片段长度为：409bp；f、猪的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ATCCTGCCATTCATCATTACCGC3’；下游引物：5’TGTTCTACGGGTTGTCCTCC3’；扩增片段长度为：485bp；g、鼠的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CTTAACCTGAATTGGGGGCCA3’；下游引物：5’GTATGAGATGGAGGCTAGTTGG3’；扩增片段长度为：73bp；h、马的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCAGCTAACCCTCTCAGCAC3’；下游引物：5’CGTATGGGTGTTCCACTGGC3’；扩增片段长度为：271bp；i、兔的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGGGAGCAACCGTAATCACT3’；下游引物：5’TCTACTGGTTGGCCTCCGAT3’；扩增片段长度为：610bp；j、猫的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCAATTCCATACATCGGGACT3’；下游引物：5’TGTTAGGGTTAGGAGATCCGC3’；扩增片段长度为：555bp；k、鹿的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TATTGACCTCCCAGCCCCA3’；下游引物：5’GGGTATTCAACTGGCTGTCCT3’；扩增片段长度为：984bp；l、鸡的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CAGCAGACACATCCCTAGCC3’；下游引物：5’TGGTTGGCTTCCGATTCAGG3’；扩增片段长度为：860bp。基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒的使用方法，包括如下步骤：步骤一、饱血库蠓标本通过灯诱法和网扫法采集于野外，置于无水乙醇中保存；在体视镜下将饱血腹部分离、保存并做好标记，以备后续分子鉴定；其余部分制成永久玻片，以备形态学鉴定；步骤二、将分离得到的饱血腹部用蒸馏水洗涤、浸泡，利用TIANampGenomicDNAKit试剂盒提取其基因组DNA，置于-20℃保存备用；步骤三、以上述待检测样本DNA、12种寄主动物DNA阳性对照以及蒸馏水阴性对照为模板，分别加入12种常见寄主动物Cytb基因的特异性扩增引物，配制PCR反应体系，进行PCR扩增；步骤四、取5-10μL的PCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，与DNAMarker或阳性对照条带进行比对判断出待测样品扩增条带的大小，或者将待测样品与阳性对照条带，即人131bp、牛728bp、羊346bp、鸭210bp、狗409bp、猪485bp、鼠73bp、马271bp、兔610bp、猫555bp、鹿984bp、鸡860bp进行比对，确定待测样品条带大小；步骤五、若阴性对照没有扩增出产物，而阳性对照和待测样品有相应条带，则可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有12种常见寄主动物Cytb基因特异性扩增的PCR引物，引物序列及其扩增片段长度如下：/na、人的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TCTCCGATCCGTCCCTAACA 3’；下游引物：5’GTGATTGGCTTAGTGGGCGA 3’；扩增片段长度为：131bp；/nb、牛的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACACGCAAACGGAGCTTCA 3’；下游引物：5’TAGGCATTGGCTGAGTGGTC 3’；扩增片段长度为：728bp；/nc、羊的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGCGCCATGCTACTAATTCTTG 3’；下游引物：5’GATGTTCGACTGGCTGTCCT 3’；扩增片段长度为：346bp；/nd、鸭的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ACATCGGACAGACCCTGGTA 3’；下游引物：5’AGAAGTAGGGGTGGAATGGGA 3’；扩增片段长度为：210bp；/ne、狗的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACATCGGACACAGCCACAG 3’；下游引物：5’AGCTGCGATGATGAAAGGGA 3’；扩增片段长度为：409bp；/nf、猪的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ATCCTGCCATTCATCATTACCGC 3’；下游引物：5’TGTTCTACGGGTTGTCCTCC 3’；扩增片段长度为：485bp；/ng、鼠的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CTTAACCTGAATTGGGGGCCA 3’；下游引物：5’GTATGAGATGGAGGCTAGTTGG 3’；扩增片段长度为：73bp；/nh、马的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCAGCTAACCCTCTCAGCAC 3’；下游引物：5’CGTATGGGTGTTCCACTGGC 3’；扩增片段长度为：271bp；/ni、兔的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGGGAGCAACCGTAATCACT 3’；下游引物：5’TCTACTGGTTGGCCTCCGAT 3’；扩增片段长度为：610bp；/nj、猫的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCAATTCCATACATCGGGACT 3’；下游引物：5’TGTTAGGGTTAGGAGATCCGC 3’；扩增片段长度为：555bp；/nk、鹿的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TATTGACCTCCCAGCCCCA 3’；下游引物：5’GGGTATTCAACTGGCTGTCCT 3’；扩增片段长度为：984bp；/nl、鸡的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CAGCAGACACATCCCTAGCC 3’；下游引物：5’TGGTTGGCTTCCGATTCAGG 3’；扩增片段长度为：860bp。/n...

【技术特征摘要】
1.基于物种Cytb基因的吸血蠓常见寄主鉴定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有12种常见寄主动物Cytb基因特异性扩增的PCR引物，引物序列及其扩增片段长度如下：
a、人的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TCTCCGATCCGTCCCTAACA3’；下游引物：5’GTGATTGGCTTAGTGGGCGA3’；扩增片段长度为：131bp；
b、牛的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACACGCAAACGGAGCTTCA3’；下游引物：5’TAGGCATTGGCTGAGTGGTC3’；扩增片段长度为：728bp；
c、羊的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGCGCCATGCTACTAATTCTTG3’；下游引物：5’GATGTTCGACTGGCTGTCCT3’；扩增片段长度为：346bp；
d、鸭的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ACATCGGACAGACCCTGGTA3’；下游引物：5’AGAAGTAGGGGTGGAATGGGA3’；扩增片段长度为：210bp；
e、狗的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACATCGGACACAGCCACAG3’；下游引物：5’AGCTGCGATGATGAAAGGGA3’；扩增片段长度为：409bp；
f、猪的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ATCCTGCCATTCATCATTACCGC3’；下游引物：5’TGTTCTACGGGTTGTCCTCC3’；扩增片段长度为：485bp；
g、鼠的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CTTAACCTGAATTGGGGGCCA3’；下游引物：5’GTATGAGATGGAGGCTAGTTGG3’；扩增片段长度为：73bp；
h、马的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCAGCTAACCCTCTCAGCAC3’；下游引物：5’CGTATGGGTGTTCCACTGGC3’；扩增片段长度为：271bp；
i、兔的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGGGAGCAACCGTAATCACT3’；下游引物：5’TCTACTGGTTGGCCTCCGAT3’；扩增片段长度为：610bp；
j、猫的Cytb基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCAATTCCATACATCGGGACT3’；下...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢雪，侯晓晖，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52