一种杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，所述检测方法对生殖细胞染色体进行了荧光定位分析，检测速度较快，检测精度高，检测方法方便，为检测杂交鱼是否能越过减数分裂染色体配对的生殖障碍及产生的配子的遗传稳定性提供了重要的方法，在鱼类遗传育种实践中具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法
本专利技术涉及鱼类遗传方式的检测的领域，尤其涉及一种杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法。
技术介绍
减数分裂是生物细胞中染色体数目减半的分裂方式。生殖细胞分裂时，染色体只复制一次，细胞连续分裂两次，这是染色体数目减半的一种特殊分裂方式。减数分裂不仅是保证物种染色体数目稳定的机制，同时也是物种适应环境变化不断进化的机制。鱼类减数分裂染色体行为研究，直接关系到其生殖育性，可以有效的指导鱼类遗传育种，特别是鱼类远缘杂交育种。在鱼类远缘杂交中，涉及异源染色体组需要克服“染色体配对”障碍问题。越来越多的研究表明，合适亲本组合的鱼类远缘杂交可以越过生殖障碍，产生可育的杂交后代。其越过生殖障碍过程中的减数分裂染色体行为，特别是同源染色体的配对行为，可以解析远缘杂交相关多倍体发生机制，也可以预测杂交组合的相容性以及是否具备越过生殖障碍的能力，在指导遗传育种研究方面极具应用价值。传统的减数分裂观察只能确定二价体数目，不能从遗传的角度揭示配对特征。故无法对杂交育种过程中，生殖细胞的配对进行全面分析。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，旨在解决现有技术中无法对杂交育种过程中，无法明确解析杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的问题。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：分别提供父本二倍体实验鱼、母本二倍体实验鱼、二倍体第一代杂交鱼和异源四倍体杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片；其中，所述特异性探针分别选自二倍体实验鱼5SrDNA探针及着丝粒重复序列探针的至少一种，且所述特异性探针在非选取的二倍体实验鱼的染色体上不能产生荧光信号；将所述父本二倍体实验鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述母本二倍体实验鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述二倍体第一代杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述异源四倍体杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片与分别所述荧光标记的纯化探针进行荧光原位杂交反应得到荧光原位杂交反应体系，检测并分析所述荧光原位杂交反应体系的信号。本专利技术提供了一种杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，具有以下优点：第一，以父本二倍体实验鱼、母本二倍体实验鱼，二倍体第一代杂交鱼和异源四倍体杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞为检测对象，同时对上述三代不同的鱼类的减数分裂时期的生殖细胞进行分析，分析其染色体的分裂及配对情况，进一步系统地解析了不同倍性杂交鱼类的生长过程生殖细胞减数分裂染色体配对特征。第二，所述特异性探针分别选自二倍体实验鱼5SrDNA探针及着丝粒重复序列探针的至少一种，且所述特异性探针在非选取的二倍体实验鱼的染色体上不能产生荧光信号；以二倍体实验鱼5SrDNA探针及着丝粒重复序列探针的至少一种为检测探针，在鱼类基因组中，5SrDNA是编码5SrRNA的基因，是真核生物中的一类高度保守的串联重复序列，其拷贝数非常大，采用5SrDNA作为探针，可以在染色体中期分裂相中快速进行荧光定位，有利于进行荧光原位反应以及对荧光强度进行分析；着丝粒重复序列探针的信号在染色体的着丝粒位置处，是着丝粒特异性定位串联重复序列，采用其作为探针可以清楚地对染色体分裂相快速进行荧光定位，有利于进行荧光原位反应以及对荧光强度进行分析，判断携带信号的染色体数目。第三，将实验鱼生殖细胞减数分裂染色体分裂相与探针进行荧光原位杂交反应得到荧光原位杂交反应体系，检测并分析所述荧光原位杂交反应体系的信号；采用荧光原位杂交反应对生殖细胞减数分裂染色体配对方式进行检测，其检测速度较快，检测精度高，检测方法方便，为检测杂交鱼是否能越过减数分裂染色体配对的生殖障碍及产生的配子的遗传稳定性提供了重要的方法，在鱼类遗传育种实践中具有重要意义。附图说明图1是本专利技术实施例2提供的340bp-5S-rDNA在母本二倍体红鲫实验鱼的FISH定位图。图2是本专利技术实施例2提供的340bp-5S-rDNA在二倍体第一代鲫鲤杂交鱼的FISH定位图。图3是本专利技术实施例2提供的340bp-5S-rDNA在二倍体第一代鲫鲤杂交鱼的FISH定位图。图4是本专利技术实施例2提供的340bp-5S-rDNA在异源四倍体鲫鲤杂交鱼的FISH定位图。图5是本专利技术实施例3提供的263bp-红鲫着丝粒重复序列在二倍体第一代鲫鲤杂交鱼的FISH定位图。图6是本专利技术实施例3提供的263bp-红鲫着丝粒重复序列在异源四倍体鲫鲤杂交鱼的FISH定位图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。在本专利技术的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本专利技术的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。本专利技术实例提供一种杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：G01.分别提供父本二倍体实验鱼、母本二倍体实验鱼，二倍体第一代杂交鱼和异源四倍体杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片；G02.提供特异性探针并对所述特异性探针进行荧光标记、纯化得到荧光标记的纯化探针，其中，所述特异性探针分别选自二倍体实验鱼5SrDNA探针及着丝粒重复序列探针的至少一种，且所述特异性探针在非选取的二倍体实验鱼的染色体上不能产生荧光信号；G03.将所述父本二倍体实验鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述母本二倍体实验鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述二倍体第一代杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述异源四倍体杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片与分别所述荧光标记的纯化探针进行荧光原位杂交反应得到荧光原位杂交反应体系，检测并分析所述荧光原位杂交反应体系的信号。本专利技术提供了一种杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，第一，以父本二倍体实验鱼、母本二倍体实验鱼，二倍体第一代杂交鱼和异源四倍体杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞为检测对象，同时对上述三代不同的鱼类的减数分裂时期的生殖细胞进行分析，分析其染色体的分裂及配对情况，进一步系统地解析了不同倍性杂交鱼类的生长过程生殖细胞减数分裂染色体配对特征。第二，其中，所述特异性探针分别选自二倍体实验鱼5SrDNA探针及着丝粒重复序列探针的至少一种，且所述特异性探针在非选取的二倍体实验鱼的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：/n分别提供父本二倍体实验鱼、母本二倍体实验鱼、二倍体第一代杂交鱼和异源四倍体杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片；/n提供特异性探针并对所述特异性探针进行荧光标记、纯化得到荧光标记的纯化探针，其中，所述特异性探针分别选自二倍体实验鱼5S rDNA探针及着丝粒重复序列探针的至少一种，且所述特异性探针在非选取的二倍体实验鱼的染色体上不能产生荧光信号；/n将所述父本二倍体实验鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述母本二倍体实验鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述二倍体第一代杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述异源四倍体杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片与分别所述荧光标记的纯化探针进行荧光原位杂交反应得到荧光原位杂交反应体系，检测并分析所述荧光原位杂交反应体系的信号。/n

【技术特征摘要】
1.一种杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
分别提供父本二倍体实验鱼、母本二倍体实验鱼、二倍体第一代杂交鱼和异源四倍体杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片；
提供特异性探针并对所述特异性探针进行荧光标记、纯化得到荧光标记的纯化探针，其中，所述特异性探针分别选自二倍体实验鱼5SrDNA探针及着丝粒重复序列探针的至少一种，且所述特异性探针在非选取的二倍体实验鱼的染色体上不能产生荧光信号；
将所述父本二倍体实验鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述母本二倍体实验鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述二倍体第一代杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片、所述异源四倍体杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片与分别所述荧光标记的纯化探针进行荧光原位杂交反应得到荧光原位杂交反应体系，检测并分析所述荧光原位杂交反应体系的信号。


2.根据权利要求1所述的杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，其特征在于，
所述父本二倍体实验鱼为父本二倍体鲤实验鱼；所述母本二倍体实验鱼为母本二倍体红鲫实验鱼；所述二倍体第一代杂交鱼为二倍体第一代鲫鲤杂交鱼；所述异源四倍体杂交鱼为异源四倍体鲫鲤杂交鱼。


3.根据权利要求1或2所述的杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，其特征在于，分别提供父本二倍体实验鱼、母本二倍体实验鱼、二倍体第一代杂交鱼和异源四倍体杂交鱼的减数分裂时期的生殖细胞的染色体制片玻片的步骤中，所述染色体制片玻片的制备方法包括如下步骤：
取各实验鱼的精巢作为原材料，对所述精巢进行前处理得到生殖细胞；将所述生殖细胞进行低渗处理，将低渗处理后的生殖细胞进行分离得到细胞沉淀，将所述细胞沉淀保存于保存液中，重复处理2～3次得到处理后的细胞；将所述处理后的细胞滴加于玻片上，进行烘干，制备得到所述染色体制片玻片。


4.根据权利要求3所述的杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，其特征在于，对所述精巢进行前处理得到生殖细胞的步骤中，所述前处理包括如下步骤：将所述精巢进行剪碎，浸泡于生理盐水中进行清洗处理；将清洗处理得到的精巢进行静置处理得到上清液，对所述上清液进行分离处理，收集沉淀得到所述生殖细胞；和/或，
将所述生殖细胞进行低渗处理的步骤中，所述低渗处理包括如下步骤：将所述生殖细胞在0.05～0.1mol/LKCl低渗液中低渗处理3-4h。


5.根据权利要求4所述的杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，其特征在于，所述精巢选自发育月龄为11～12个月的鱼类的精巢或发育月龄为13～16个月的鱼类的精巢。


6.根据权利要求2所述的杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，其特征在于，
所述红鲫5srDNA重复序列探针的长度为340～350bp；和/或，
所述红鲫着丝粒重复序列探针的长度为260～270bp。


7.根据权利要求6所述的杂交鱼生殖细胞减数分裂染色体配对的检测方法，其特征在于，
所述红鲫5srDNA重复序列探针的上游引物序列如SEQ.No.1，为5'-TATGCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张纯，刘少军，朱辣，陶敏，周毅，罗凯坤，赵如榕，周罗璟，周天，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43