一种鸡“鹿角”冠相关的分子标记及其分型方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种鸡“鹿角”冠相关的分子标记及其分型方法和应用。所述“鹿角”冠相关的分子标记分型方法是通过抽提样本血液DNA样本后对其进行多重PCR扩增，PCR产物纯化后进行延伸反应，将产物进行测序对变异位点进行分型，然后淘汰杂合子个体。本发明专利技术可用于育种中对“鹿角”冠性状的提纯以及应用于培育具有“鹿角”冠性状的新品系以及新的配套系。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡“鹿角”冠相关的分子标记及其分型方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种鸡“鹿角”冠相关的分子标记及其分型方法和应用。
技术介绍
因为外貌特征往往是品种的标志性性状，所以外貌选育在鸡育种和保种中尤为重要，外貌特征也是普通消费者辨别品种尤其是地方品种的重要依据。鸡冠形状就是一些品种的标志特征之一，就像玫瑰冠是我国泰和丝羽乌骨鸡的重要特征、毛冠是北京油鸡的重要特征、双冠是贵妃鸡的重要外貌特征一样，鹿角冠(冠尾分叉，且部分具有冠齿，形似鹿角)则是我国河田鸡和象洞鸡的主要特征。相对于单冠，鹿角冠呈现常染色体显性遗传。在动物的育种生产中，单基因性状的选择提纯有三种方案：①表型直接选淘，逐渐降低群体中相关的隐性等位基因的频率；②测交剔除掉隐性等位基因。③分子标记辅助选择，直接剔除相应的等位基因。其中方案“①”通过表型的直接选淘需要多个世代，而且隐性等位基因会一直存在群体中，无法完全剔除掉隐性等位基因。方案“②”理论上可以经过一个世代剔除掉相关的隐性等位基因，但是实际的操作过程中由于过程繁琐很容易出现差错。方案“③”具有快速，过程简单的特点，其前提是已知与性状完全连锁的分子标记或者性状相关的致因突变。“鹿角”冠性状，是单基因控制的性状，其对野生型的单冠性状为显性。目前，河田鸡/象洞鸡群体或者利用河田鸡/象洞鸡为素材合成具有“鹿角”冠性状的群体中剔除野生型等位基因的方式只能采用方案“①”或者方案“②”。在前期研究中，我们鉴定到了与“鹿角”完全连锁的突变位点，基于前期研究结果本专利技术提供一种分子标记及其辅助选择方法对“鹿角”冠基因型进行精准选择。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种分子标记辅助选择的方法，用于检测鸡“鹿角”冠性状个体的基因型，从而对携带野生型(单冠)等位基因的个体进行精准淘汰。本专利技术通过下述技术方案实现上述技术效果：一种鸡“鹿角”冠相关的分子标记，为具有SEQ.No.4所示和/或SEQ.No.5所示的基因序列。一种所述鸡“鹿角”冠相关的分子标记的分型方法，其是通过抽提样本血液DNA样本后对其进行多重PCR扩增，PCR产物纯化后进行延伸反应，将产物进行测序对变异位点进行分型，然后淘汰杂合子个体，其中变异位点为扩增片段的第44位核苷酸，野生型等位基因序列如SEQ.No.4所示；突变基因序列如SEQ.No.5所示。优选地，所述的鸡“鹿角”冠相关的分子标记及其分型方法具体包括如下步骤：步骤1：样本DNA抽提：根据采用苯酚-氯仿抽提法提取样本血液DNA；步骤2：目的位点分型：(1)多重PCR扩增：正向引物和反向引物混合得到混合引物；向其中加入样本血液DNA、核苷酸后用水定容配制PCR体系，按照95℃3min；94℃15s，55℃15s，35循环；72℃30s；72℃3min的扩增条件进行扩增反应，得到PCR产物；(2)PCR产物纯化：使用ExoI，FastAP和ExoIbuffer对PCR产物进行纯化；(3)延伸反应：将纯化后的PCR产物加入SnapshotMix试剂、延伸引物并用水定容，按照96℃1min；96℃10s，52℃5s，30循环；60℃30s的扩增条件进行延伸反应，得到延伸产物；(4)测序分型：将延伸产物变性后上测序仪测序，根据目的位点的核苷酸淘汰杂合子个体。更优选地，所述的鸡“鹿角”冠相关的分子标记方法具体包括如下步骤：步骤1：样本DNA抽提：根据采用苯酚-氯仿抽提法提取样本血液DNA。基因组DNA的抽提方法采用苯酚-氯仿抽提法(奥斯泊F等，1998)，其具体步骤如下：(1)取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL1×SET缓冲液、12.5μL20％SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；(2)取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10000rpm离心10min；(3)取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10000rpm离心10min；(4)取上清，加入500μL氯仿-异戊醇(其中氯仿和异戊醇体积比为23：1)轻摇20min，10000rpm离心10min；(5)取上清，加入1mL冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀DNA，10000rpm离心10min后倒出乙醇；(6)用1mL75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；(7)待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；(8)存放于-20℃冰箱中保存备用。步骤2：目的位点分型(1)多重PCR扩增将正向引物和反向引物分别用1*TE溶解至浓度为10pmol，将正向引物和反向引物混匀后离心得到混合引物；按照如下体积配比配制PCR体系：DNA1-2μL，2*PCRmix7.5μL，混合引物2μL，加入H2O补至15μL，将PCR体系转移至96微孔板进行PCR反应，按照95℃3min；94℃15s，55℃15s，35循环；72℃30s；72℃3min的扩增条件进行扩增反应；其中正向引物的序列如SEQ.No.1所示，反向引物的序列如SEQ.No.2所示；(2)PCR产物纯化取3μLPCR产物，向其中加入ExoI0.2μL，FastAP0.8μL和ExoIbuffer0.7μL，使用H2O补至7μL后混匀，依次按照37℃15min，80℃15min的纯化条件对PCR产物进行纯化；该步骤中用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的DNTP。(3)延伸反应将纯化后的PCR产物进行延伸反应，按照如下体积比的各组分配制延伸反应体系：纯化后PCR产物2μL，SnapshotMix试剂1μL，延伸引物1μL，加H2O补至6μL，将其转移至96微孔板进行PCR反应，按照96℃1min；96℃10s，52℃5s，30循环；60℃30s的扩增条件进行扩增反应得到延伸产物，其中延伸引物序列如SEQ.No.3所示；(4)测序分型取1μL延伸产物，加10μL上样Hidi，95℃变性3min，立即冰水浴，上测序仪测序，根据测序结果确定样本基因型；选留基因型为GG的个体，淘汰目的位点基因型为AG的个体。所述的目的基因的野生型等位基因序列如SEQ.No.4所示；目的基因的突变型等位基因序列如SEQ.No.5所示。二者的区别在于基因的第44位核苷酸不同。本专利技术还提供一种所述分子标记的应用，即所述的分子标记在“鹿角”冠选淘中的应用。本专利技术与现有技术相比，取得的有益的技术效果为：是针对与“鹿角”冠性状完全连锁的位点的直接选择，较之传统的表型选择精确。选择后“鹿角”冠性状不会出现分离，即不会再出现单冠个体。附图说明图1为目的位点为AG的样本的基因型测序结果。图2为目的位点为GG的样本的基因型测序结果具体实施方式以下通本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡“鹿角”冠相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为具有SEQ.No.4所示和/或SEQ.No.5所示的基因序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸡“鹿角”冠相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为具有SEQ.No.4所示和/或SEQ.No.5所示的基因序列。


2.一种如1所述的鸡“鹿角”冠相关的分子标记的分型方法，其特征在于，通过抽提样本血液DNA样本后对其进行多重PCR扩增，PCR产物纯化后进行延伸反应，将产物进行测序对变异位点进行分型，然后淘汰杂合子个体，其中变异位点为扩增片段的第44位核苷酸，野生型等位基因序列如SEQ.No.4所示；突变基因序列如SEQ.No.5所示。


3.根据权利要求2所述的鸡“鹿角”冠相关的分子标记的分型方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：
步骤1：样本DNA抽提：根据采用苯酚-氯仿抽提法提取样本血液DNA；
步骤2：目的位点分型：
(1)多重PCR扩增：正向引物和反向引物混合得到混合引物；向其中加入样本血液DNA、核苷酸后用水定容配制PCR体系，按照95℃3min；94℃15s，55℃15s，35循环；72℃30s；72℃3min的扩增条件进行扩增反应，得到PCR产物；
(2)PCR产物纯化：使用ExoI，FastAP和ExoIbuffer对PCR产物进行纯化；
(3)延伸反应：将纯化后的PCR产物加入SnapshotMix试剂、延伸引物并用水定容，按照96℃1min；96℃10s，52℃5s，30循环；60℃30s的扩增条件进行延伸反应，得到延伸产物；
(4)测序分型：将延伸产物变性后上测序仪测序，根据目的位点的核苷酸淘汰杂合子个体。


4.根据权利要求3所述的鸡“鹿角”冠相关的分子标记的分型方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：
步骤1：样本DNA抽提：根据采用苯酚-氯仿抽提法提取样本血液DNA；
步骤2：目的位点分型
(1)多重PCR扩增
将正向引物和反向引物分别用1*TE溶解至浓度为10pmol，将正向引物和反向引物混匀后离心得到混合引物；按照如下体积配比配制PCR体系：DNA1-2μL，2*PCRmix7.5μL，混合引物2μL，加入H2O补至15μL，将PCR体系转移至96微孔板进行PCR反应，按照95℃3min；94℃15s，55℃15s，35循环；72℃30s；72℃3min的扩增条件进行扩增反应，得到PCR产物；
(2)PCR产物纯化
取3μLPCR产物，向其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：许继国，罗威，聂庆华，张细权，饶友生，
申请(专利权)人：华南农业大学，南昌师范学院，
类型：发明
国别省市：广东;44