本发明专利技术提供一种用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记及检测引物对、试剂盒和应用。本发明专利技术提供了准确鉴别中国马鹿和赤鹿的5个特异性SNP位点，及一对鉴别引物，并建立了准确可靠的检测方法。本发明专利技术方法具有很好的特异性、稳定性和高灵敏度，检测限为0.25ng/ul。本发明专利技术首次将分子标记的技术应用于鉴别中国马鹿和赤鹿，有效避免了因外观形态难以区分造成的经济损失。用本发明专利技术方法检测了市场上100个鹿茸及副产品，准确率为100％。本发明专利技术简化了鉴别程序，操作简单，易于掌握，推广性强。弥补了本领域目前尚无精准鉴别中国马鹿与赤鹿产品的检测技术的不足，实现对中国马鹿与赤鹿产品的精准鉴别。
【技术实现步骤摘要】
用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记及检测引物对、试剂盒和应用
本专利技术涉及用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记及检测引物、试剂盒和应用，属于分子生物学检测
技术介绍
马鹿(Cervuselaphus)属偶蹄目、鹿科、鹿属，全世界有22个亚种，主要分为东部马鹿和西部马鹿两大类群。中国分布8个亚种(西藏亚种、东北亚种、阿拉善亚种、阿尔泰亚种、四川亚种、天山亚种、塔里木亚种、甘肃亚种)。目前我国在亚种基础上已培育了3个培育品种(塔河马鹿、清原马鹿、天山马鹿)、1个地方品种(东北马鹿)、5个饲养种群(天山种群、阿尔泰种群、甘肃种群、阿拉善种群和青海种群)。鹿茸等产品应用于人类的医疗保健已有两千多年的历史。鹿肉细嫩，味道鲜美，具有高蛋白、低脂肪、易消化的特点，且有一定的食用价值。中国历代本草和现代药典都记载梅花鹿和马鹿为地道鹿产品，其它鹿种产品视为替代品、习用品，甚至伪品。随着需求的日益增加，市场出现的鹿产品多种多样，良莠不齐，经常出现以驯鹿、赤鹿产品被当作梅花鹿、马鹿产品出售，以次充好，甚至有出现其他非鹿科动物(如牛、猪、羊等)产品以假乱真，被当作鹿产品来销售。严重扰乱了鹿茸及副产品的市场秩序，进而阻碍了鹿产业的深度健康发展。市场上出现鹿茸及副产品的替代品原因众多，其中最主要的是新西兰每年近千吨赤鹿产品涌入中国市场，以假乱真，以次充好的现象严重，从而使得消费者遭受经济损失，阻碍我国养鹿业健康发展。目前对鹿产品鉴别的方法大致可分为四类：性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别和分子鉴别。性状鉴别和显微鉴别最为简单方便，但其准确性也最低。理化鉴别方法较之性状鉴别和显微鉴别，准确性较高，主要有光谱鉴别、免疫学方法、醋酸纤维素膜电泳等。分子鉴别方法是目前研究的热点，具有准确性高、反应灵敏、操作简单等优点，且分子标记不受环境因素影响，因而被广泛应用于动物产品鉴别及种源鉴定。但是，目前我们缺乏有效鉴别赤鹿和中国马鹿产品的检测技术，赤鹿和中国马鹿产品的精准鉴别依然是本领域的难题。因此，急需开展中国马鹿和赤鹿亚种间精准鉴别的研究工作，实现鹿产品溯源，保护我国马鹿资源。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记及检测引物、试剂盒和应用。本专利技术获得了可以用于精准鉴别中国马鹿与赤鹿产品的SNP标记、鉴定方法和鉴定试剂盒，实现了马鹿茸及副产品的精准鉴别，为马鹿产品精准检测标准的制定提供直接依据。本专利技术提供一种用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记，所述SNP标记包括5个SNP标记位点：S-1、S-2、S-3、S-4、S-5；位点信息如表1所示：表1、本专利技术用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记位点标记鹿mtDNA基因组位点赤鹿马鹿S-1COX3基因500bp片段第65bpGAS-2COX3基因500bp片段第139bpCTS-3COX3基因500bp片段第208bpTCS-4COX3基因500bp片段第286bpAGS-5COX3基因500bp片段第418bpTC本专利技术还提供用于鉴别中国马鹿和赤鹿的引物对，所述引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。用所述引物对扩增待测样品，若扩增得到的片段序列的第65位、第139位、第208位、第286位、第418位的碱基，分别为G、C、T、A、T(即序列如SEQIDNO.3所示)，则待测样品为赤鹿；若分别为A、T、C、G、C(即序列如SEQIDNO.4所示)，则待测样品为中国马鹿。本专利技术还提供所述SNP标记或引物对在鉴别中国马鹿和赤鹿中的应用，及制备试剂盒或在检测方法中的应用，所述试剂盒或检测方法的用途为鉴别中国马鹿和赤鹿。本专利技术进一步提供一种鉴别中国马鹿和赤鹿的方法，所述方法是：提取待测样本DNA，用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示引物对进行PCR扩增；对PCR产物进行测序，根据SNP标记位点碱基即可鉴别待测样品是赤鹿还是中国马鹿。本专利技术还提供一种鉴别中国马鹿和赤鹿的试剂盒，所述试剂盒包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示引物对。本专利技术确定5个用于鉴别中国马鹿与赤鹿特异性的SNP位点，得到了一对鉴别引物，建立了鉴别中国马鹿和赤鹿的的方法。为中国马鹿与赤鹿产品鉴别提供了稳定、可靠的分子检测方法。本专利技术弥补了本领域目前尚无鉴别中国马鹿与赤鹿产品的检测技术的不足，实现对中国马鹿与赤鹿产品的精准鉴别。本专利技术鉴别中国马鹿和赤鹿的实验基础是PCR反应，因此设计鉴定性引物是其中关键环节，引物因素直接影响PCR特异性和灵敏度。一方面，引物必须具有物种的特异性，且扩增的片段必须包含中国马鹿共有SNP和赤鹿独有的SNP差异位点，这样可以通过测序结果直接比对鉴定。引物设计时要排除引物与模板间的相互干扰，如引物二聚体、非特异性扩增等。另一方面，由于市售鹿茸及副产品经过不同工艺加工处理，导致鹿茸及副产品提取的DNA样本可能会有不同程度的降解。为了应用于市场中马鹿鹿茸及副产品的实际检测，因此，本专利技术选择扩增的目的片段大小为570bp左右，从而可以避免经高温处理的鹿茸及副产品中DNA遭到破坏而无法检测。这样极大提高了检测的准确性。本专利技术具有下列优点及有益效果：(一)本专利技术提供了准确鉴别中国马鹿和赤鹿的5个特异性SNP位点，设计了一对鉴别引物，并建立了准确可靠的检测方法。本专利技术提供的方法用于鉴别中国马鹿和赤鹿，精确可靠，分子标记组合简化了鉴别程序，操作简单，易于掌握，推广性强。本专利技术方法具有很好的特异性、稳定性和高灵敏度，检测限为0.25ng/ul。(二)本专利技术首次将分子标记的技术应用于鉴别中国马鹿和赤鹿，有效避免了因外观形态难以区分造成的经济损失，有助于解决鹿产品市场混乱和种质资源混杂的问题，可提高鹿产品市场的监管和保护力度。用本专利技术方法检测了辽宁西丰马鹿产品市场的100个鹿茸及副产品(采自5个商店)。结果表明87个鹿茸片中其中赤鹿占94％，马鹿茸占6％。13个鹿鞭产品中赤鹿鞭占85％，马鹿鹿鞭占15％。本专利技术分子鉴定的方法与用NJ法构建系统发育树进行聚类分析来验证检测结果完全一致，准确率为100％。(三)本专利技术从基因水平上拓展了马鹿可用标记位点范围，为马鹿种质资源鉴定提供了新思路和方法，为育种和生产中种质资源选择的准确性提供了保障，对马鹿种质资源鉴定，DNA指纹图谱绘制，本土品种保护和管理等方面具有重要理论与应用价值。附图说明图1为赤鹿与中国马鹿mtDNA序列差异性SNP位点。CL：赤鹿；AL：阿尔泰马鹿；DB：东北马鹿；GS：甘肃马鹿；QY：清原马鹿；TL：塔河马鹿；TS：天山马鹿。...
【技术保护点】
1.一种用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记，其特征是，所述SNP标记包括5个SNP标记位点：S-1、S-2、S-3、S-4、S-5；/n所述S-1表示该SNP位点位于SEQ ID NO.3所示核苷酸序列第65bp处，该处核苷酸序列为G/A；/n所述S-2表示该SNP位点位于SEQ ID NO.3所示核苷酸序列第139bp处，该处核苷酸序列为C/T；/n所述S-3表示该SNP位点位于SEQ ID NO.3所示核苷酸序列第208bp处，该处核苷酸序列为T/C；/n所述S-4表示该SNP位点位于SEQ ID NO.3所示核苷酸序列第286bp处，该处核苷酸序列为A/G；/n所述S-5表示该SNP位点位于SEQ ID NO.3所示核苷酸序列第418bp处，该处核苷酸序列为T/C。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记，其特征是，所述SNP标记包括5个SNP标记位点：S-1、S-2、S-3、S-4、S-5；
所述S-1表示该SNP位点位于SEQIDNO.3所示核苷酸序列第65bp处，该处核苷酸序列为G/A；
所述S-2表示该SNP位点位于SEQIDNO.3所示核苷酸序列第139bp处，该处核苷酸序列为C/T；
所述S-3表示该SNP位点位于SEQIDNO.3所示核苷酸序列第208bp处，该处核苷酸序列为T/C；
所述S-4表示该SNP位点位于SEQIDNO.3所示核苷酸序列第286bp处，该处核苷酸序列为A/G；
所述S-5表示该SNP位点位于SEQIDNO.3所示核苷酸序列第418bp处，该处核苷酸序列为T/C。
2.如权利要求1所述的用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记，其特征是，所述5个SNP标记位点位于鹿mtDNA基因组的COX3基因上。
3.如权利要求1所述的用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记，其特征是，所述5个SNP标记所在DNA片段可由序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物扩增得到。
4.如权利要求1所述的用于鉴别中国马鹿和赤鹿的SNP标记，其特征是，当所述SNP标记S-1～S-5位点的碱基分别是G、C、T、...
【专利技术属性】
技术研发人员：邢秀梅，朱燕敏，王天骄，刘华淼，董依萌，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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