基于物种COI基因的七种蓝舌病毒媒介库蠓鉴定方法，它含有七种蓝舌病毒媒介库蠓COI基因的扩增引物及其基因组DNA，通过提取待测库蠓基因组DNA，采用上述引物进行PCR扩增，再根据扩增产物大小鉴定出相应的库蠓物种。本发明专利技术提供扩增七种库蠓物种COI基因的特异性扩增引物及其鉴定方法，有利于实现媒介库蠓的快速、准确鉴定。
【技术实现步骤摘要】
基于物种COI基因的七种蓝舌病毒媒介库蠓物种鉴定方法
本专利技术涉及蓝舌病毒主要传播媒介库蠓物种鉴定领域。
技术介绍
库蠓属Culicoides昆虫隶属于双翅目Diptera、长角亚目Nematocera、蠓科Ceratopogonidae，是吸血蠓中种类最多、数量最大的一类昆虫。目前全世界已发现1400多种，广泛分布于世界各地。迄今，我国已发现340余种。库蠓体型微小，可直接侵袭人和动物，造成过敏反应，或者间接传播人畜共患传染病。当吸血蠓吸食到受病毒感染的宿主血液后，通过其唾液将病原体带至其他宿主体内，可传播包括蓝舌病毒（BTV）、流行性出血热病毒（EHDV）、Schmallenberg病毒（SBV）等在内的多种病原，其中蓝舌病毒所引发的蓝舌病在世界范围内广泛传播和流行，已在欧洲等地爆发给当地畜牧业带来巨大的经济损失，对农业的发展构成了严重的威胁。目前，世界范围内已经明确的蓝舌病传播媒介包括不显库蠓复组obsoletuscomplex(Culicoidesobsoletus,Culicoidesscoticus,Culicoidesdewulfi和Culicoideschiopterus)、灰黑库蠓种团pulicarisgroup(Culicoidespulicaris和Culicoidespunctatus)和残肢库蠓Culicoidesimicola等，这些库蠓作为蓝舌病毒的重要载体，与医疗卫生和兽医等领域息息相关。因此，库蠓在医学研究及疾病传播领域中具有不可忽视的地位，媒介库蠓的准确鉴定是流行病传播环节中控制媒介的重要基础，是蠓传疾病监测、防治的关键。目前，鉴定库蠓物种的方法主要是传统形态分类和分子鉴定方法。传统形态分类通过对库蠓形态特征进行检索鉴定，但由于库蠓体型微小，形态鉴定步骤繁琐以及近似物种特征难以界定等，尤其是复组(complex)或种团(group)内的物种。同时，形态鉴定是建立在完整成体的基础上，对肢体残缺或幼期虫态的个体鉴定困难。此外，鉴定人员需具备非常专业的鉴定知识和足够丰富的鉴定经验，才能有效的鉴定库蠓物种。随着分子生物学的发展，分子鉴定技术已逐渐成为物种鉴定的常用方法。分子鉴定技术通过对特定基因扩增、测序以及与GenBank等公共数据库进行序列比对来鉴定物种，但此方法需要测序，对于大样本量进行鉴定时经济成本较高。因此，亟需寻求一种快速、简便、准确且成本较低的方法，以弥补常规鉴定方法的不足。COI基因是线粒体基因组中编码细胞色素C氧化酶亚基I的基因，是目前分子研究领域较为常用的分子标记。该基因与线粒体其他基因相比，具有较为保守的结构和大小，包含大量的遗传信息，并且在同一物种不同个体之间只有2%以下差异，COI基因已用于多种生物类群的分子鉴定。本专利技术提供了蓝舌病毒7种主要的媒介库蠓（Culicoidesobsoletus,Culicoidesscoticus,Culicoidesdewulfi,Culicoideschiopterus,Culicoidespulicaris,Culicoidespunctatus和Culicoidesimicola）的COI基因特异性引物及其物种鉴定方法，有利于实现上述七种库蠓的快速、准确鉴定。
技术实现思路
：本专利技术目的在于提供基于物种COI基因序列的七种蓝舌病毒媒介库蠓物种鉴定方法。通过提取待鉴定蠓组织基因组DNA，利用不同库蠓的特异性引物进行PCR扩增其COI基因，再比对PCR产物条带大小，实现七种蓝舌病毒媒介库蠓的快速、准确鉴定。为实现上述目标，所采用的技术方案如下：1、一种基于物种COI基因的七种蓝舌病毒媒介库蠓鉴定方法，含有七种库蠓的COI基因特异性扩增引物，引物序列及产物大小如下：a、C.obsoletusCOI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCCCCCGATATAGCCTTTCC3；下游引物：5’TCGGTCGGTTAAGAGCATGG3’；扩增片段长度为：375bp；b、C.scoticusCOI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCTTTAATACTAGGTGCCCCAGA3’；下游引物：5’CCTGCATGGGAGACATTTGC3’；扩增片段长度为：170bp；c、C.imicolaCOI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCCTCCTGCTGGGTCAAAAA3’；下游引物：5’GTCACCCGGGTTCTTTAATTGG3’；扩增片段长度为：551bp；d、C.dewulfiCOI基因的特异性扩增引物上游引物：5’GCCGGAACAGGTTGAACAGT3’；下游引物：5’AATTGCCAGGTCTACCGAGG3’；扩增片段长度为：78bp；e、C.punctatusOI基因的特异性扩增引物，上游引物：COI5’TAGGGGCCCCAGACATAGC3’；下游引物：5’AAAATAGGGTCTCCGCCTCC3’；扩增片段长度为：430bp；f、C.chiopterusCOI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TTTGGAGTATGGGCCGGAAT3’；下游引物：5’ACAGTTCATCCAGTCCCTGC3’；扩增片段长度为：320bp；g、C.pulicarisCOI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CATGCCGGAGCATCCGTAG3’；下游引物：5’CTCCTCCAGCAGGGTCAAAA3’；扩增片段长度为：260bp；含有上述七种库蠓的基因组DNA，作为检测过程中的阳性对照；所述鉴定库蠓物种的方法如下：步骤1：提取待鉴定蠓种的基因组DNA，同时准备作为阳性对照的七种库蠓基因组DNA和阴性、空白对照DNA；步骤2：以上述DNA为模板，配制PCR反应体系，即将步骤1中各种基因组DNA加入到PCR反应体系中，在待鉴定蠓种管中分别加入七种不同库蠓的特异性引物进行PCR扩增；步骤3：取5-10μLPCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，凝胶成像仪照相分析，其中空白和阴性对照若未出现条带，说明检测过程无实验偏差；最后，将待测样品目的条带与阳性对照或DNAMarker电泳条带进行比对判断出扩增条带的大小，即可判断出该待测样本属于相应阳性对照的库蠓物种。PCR反应体系如下：2×ESTaqMasterMix4.5μL引物p1（100pmol/L）0.2μL引物p2（100pmol/L）0.2μL模板DNA1μLddH2O6.6μL总体积12.5μL。PCR反应条件如下：95℃预变性15min，1个循环；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；最后16℃，保存。采用上述技术方案的有益效果是：1、本专利技术采用分子技术的方法，对库蠓DNA进行PCR鉴定，由于引物的特异性，可确保鉴定的准确性和可靠性；2、本专利技术操作简单，有效缩短物种鉴定时间，重复性好本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于物种COI基因的七种蓝舌病毒媒介库蠓鉴定方法，含有七种库蠓的COI基因特异性扩增引物，引物序列及产物大小如下：/na、
【技术特征摘要】
1.一种基于物种COI基因的七种蓝舌病毒媒介库蠓鉴定方法，含有七种库蠓的COI基因特异性扩增引物，引物序列及产物大小如下：
a、C.obsoletus的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCCCCCGATATAGCCTTTCC3；下游引物：5’TCGGTCGGTTAAGAGCATGG3’；扩增片段长度为：375bp；
b、C.scoticus的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCTTTAATACTAGGTGCCCCAGA3’；下游引物：5’CCTGCATGGGAGACATTTGC3’；扩增片段长度为：170bp；
C、C.imicola的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCCTCCTGCTGGGTCAAAAA3’；下游引物：5’GTCACCCGGGTTCTTTAATTGG3’；扩增片段长度为：551bp；
d、C.dewulfi的COI基因的特异性扩增引物上游引物：5’GCCGGAACAGGTTGAACAGT3’；下游引物：5’AATTGCCAGGTCTACCGAGG3’；扩增片段长度为：78bp；
e、C.punctatus的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：COI5’TAGGGGCCCCAGACATAGC3’；下游引物：5’AAAATAGGGTCTCCGCCTCC3’；扩增片段长度为：430bp；
f、C.chiopterus的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TTTGGAGTATGGGCCGGAAT3’；下游引物：5’ACAGTTCATCCAGTCCCTGC3’；扩增片段长度为：320bp；
g、C.pulicaris的COI基因的特异性扩增引物，上...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯晓晖，卢雪，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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