与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的SNP分子标记制造技术

本发明专利技术公开了一个与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的SNP分子标记，该SNP位点位于

SNP molecular markers associated with resistance to white spot syndrome in Procambarus clarkii

【技术实现步骤摘要】
与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的SNP分子标记
本专利技术属于水产动物遗传育种
，具体涉及一个与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的SNP分子标记。
技术介绍
克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，隶属于甲壳纲、十足目、螯虾科、原螯虾属，原产于墨西哥北部和美国南部(邓沼泽2010)。因其营养丰富，口味独特，现已成为我国重要的经济养殖对象。据《2019中国小龙虾产业发展报告》报道，2018年小龙虾在中国的产量达到了1638700吨，养殖总面积达1680万亩，总产值达到3690亿元。白斑综合征病毒(Whitespotsyndromevirus，WSSV)是影响克氏原螯虾健康养殖产业发展的重要因素之一，给克氏原螯虾产量造成了一定的经济损失。WSSV是一种具有囊膜的双链DNA病毒，几乎可以感染所有的虾、蟹类等甲壳动物(Ding2015)。虾感染WSSV后，游泳速度明显变得缓慢，摄食量减少，行动迟缓，头胸甲与腹节分离，血淋巴变得稀薄不易凝固，最后病虾大规模死亡。整个发病过程一般持续3-10天，死亡率可达90％以上(闫冬春2007)。对克氏原螯虾携带WSSV情况的研究表明，池塘养殖和江河的野生克氏原螯虾均有较高的带毒率(洪徐鹏2012)。在克氏原螯虾产量最高的湖北地区，对7个主要养殖克氏原螯虾的地区的携带WSSV情况调查发现，克氏原螯虾携带WSSV的比例在40-70％之间(李青彬2018)。WSSV主要通过水平传播、垂直传播和种间转播三种方式进行传播(Chou1998)。目前，有研究报道了许多化学和物理方法用于预防和治疗该病，如病毒蛋白口服，在体内注射灭活的WSSV(Duetal2006，Zhuetal2009)，高热疗法等，这些方法虽然具有一定的可行性，但在克氏原螯虾的养殖中广泛地应用仍具有一定的难度。近年来，随着分子生物技术的发展，使得人们可以透过复杂的表面现象，剖析其遗传基础，估算其遗传的部分，DNA重组技术、转基因技术、分子标记技术等逐渐地应用在育种领域。其中，分子标记技术因具有较高的多态性、检测手段简单、开发成本低廉等优点，现广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别等方面。目前在中国对虾(降锦菲2013)、半滑舌鳎(邢贺飞2015)、草鱼(王文静2014)和凡纳滨对虾(Liuetal2014)等水产动物中已开发出了抗病分子标记，但在克氏原螯虾抗病SNP分子标记的研究仍为空白，有必要通过分子育种技术，挖掘克氏原螯虾抗病关键基因，为该虾抗病品种选育提供依据。大多数甲壳类动物缺乏适应性免疫，而依赖于先天免疫，后者分为体液免疫和细胞免疫，它们是抵抗病原体的第一道防线(Lokeretal2004；Cereniusand2004)。凝血系统，抗菌素蛋白的合成以及酚氧化酶原(proPO)激活系统在无脊椎动物中形成体液免疫(IwanagaandLee2004；Cereniusetal2008)。其中，酚氧化酶原(proPO)激活系统被认为是甲壳类动物中最重要的免疫系统(Zheng2019)，酚氧化酶原激活系统在丝氨酸蛋白酶(Serineprotease，SP)的催化下可产生有毒的反应中间体和黑色素以抵抗病原体(JiangandKanost2000)。现有研究表明，proPO在诸如结节形成，血淋巴吸引等生理过程中起着至关重要的作用(Cereniusetal2008；NappiandChristensen2005)。proPO系统可被病原体，身体损伤和微生物产物激活(Amparyupetal2013；Cereniusand2004)。在过去的几十年中，proPO在各种生物中被广泛的研究，并显示了它们在无脊椎动物免疫中的重要作用(Amparyupetal2013；Guetal2019；Dziedziechetal2019)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个与克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(WSSV)相关的SNP分子标记，该SNP分子标记的多态性位点位于克氏原螯虾酚氧化酶原基因(prophenoloxidase,proPO)第4内含子中，与克氏原螯虾抗WSSV性状有显著相关性，具有良好的多态性，利用该SNP分子标记对克氏原螯虾进行抗WSSV检测，有利于提高克氏原螯虾的抗病育种效率，加快实现克氏原螯虾抗WSSV新品种的选育。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：本专利技术通过克氏原螯虾WSSV攻毒处理及基因组DNA提取，引物设计，PCR扩增，PCR产物直接测序以及SNP分子标记的筛选与分析，用SPSS22.0软件进行数据处理，卡方检验基因型与抗病性状的显著性差异，在proPO基因的第4内含子区发现1个与克氏原螯虾抗WSSV性状显著相关的SNP位点g.7081T/C，SNP分子标记包括如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，在该序列的第451bp处有一个等位基因突变，基因型是T或C。上述SNP分子标记在辅助选育克氏原螯虾抗白斑综合征病毒品种中的应用，具体方法为：扩增含有所述SNP位点的片段，通过直接测序法对SNP位点的基因型进行分型，TT基因型是克氏原螯虾白斑综合征病抗性的有利标记。进一步地，用于扩增SNP分子标记的引物序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。附图说明图1：克氏原螯虾proPO基因第4内含子中g.7081T/C位点不同基因型的测序峰图。具体实施方式实施例1.1试验动物本实验所需的克氏原螯虾来自华中农业大学水产养殖基地，实验前在聚乙烯塑料养殖箱中暂养1周，挑选健康有活力的189尾虾开展实验。室内养殖水温24-26℃，实验期间每天投喂1次商品饲料，每周换水2次。将189只健康克氏原螯虾注射0.1mLWSSV(109拷贝)，注射部位为第二腹节。随着病毒在体内的扩散，前50个发病死亡的克氏原螯虾作为敏感群体。15天后，将50个存活的克氏原螯虾作为抗性组。1.2试验方法1.2.1克氏原螯虾基因组DNA提取取两个群体克氏原螯虾的尾部肌肉保存在装有无水乙醇的2mL离心管中，按照以下步骤提取其DNA：(1)在实验开始前将水浴锅温度设置为55℃并于冰上解冻蛋白酶K，取肌肉组织于滤纸上，吸干附着于肌肉上的液体；将肌肉装入有600μL裂解液的2mL离心管中，将肌肉组织用剪刀剪碎后加入9μL蛋白酶K；(2)将装有肌肉组织的离心管放入水浴锅中，让肌肉组织消解完全；(3)提前打开冰冻离心机，快速降温至4℃，待肌肉组织完全消解后，将其取出，冷却，向离心管中加入200μL醋酸铵(此步骤及以后操作均在冰上进行)，用力摇晃充分混匀；(4)离心后，用1000μL枪缓慢吸取上清液，将其加到1.5mL离心管中(约500μL)；加入等体积预冷异丙醇(轻轻摇晃有丝状物产生)，离心(4℃，12000r/min，10-15min)，缓慢倒出上清液，将白色白斑留下；(5)加入1mL75％乙醇洗涤，离心(4℃，12000r/min，5min)；倒出上清液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，第451位的碱基是T或C。/n

【技术特征摘要】
1.与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，第451位的碱基是T或C。


2.用于扩增权利要求1所述SNP分子标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：张龙，李艳和，石瑞雪，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42