用于鉴定实验用小型猪品种的特异性微卫星引物组合物及鉴定实验用小型猪品种的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定实验用小型猪品种的特异性微卫星引物组合物以及鉴定实验用小型猪品种的方法，所述引物组合物包括3对引物。本发明专利技术基于小型猪种基因组中的微卫星序列，通过群体试验验证并筛选得到了实验用小型猪不同品种间特异的微卫星序列及引物，优化了所述引物的试验条件和使用方法，解决了实验用小型猪品种的鉴定。

Specific microsatellite primer composition for identification of experimental miniature pig breeds and methods for identification of experimental miniature pig breeds

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定实验用小型猪品种的特异性微卫星引物组合物及鉴定实验用小型猪品种的方法
本专利技术属于基因检测
，尤其涉及一种用于鉴定实验用小型猪品种的特异性微卫星引物组合物及鉴定实验用小型猪品种的方法。
技术介绍
实验用小型猪是生物医学研究中应用最为广泛的非啮齿类大型实验动物之一，具有其它实验动物不可替代的优越性，而且作为异种器官移植最可能的供体成为研究热点，小型猪的研究和开发利用受到生物医药界的普遍关注。实验用小型猪的品种品系多种多样，在我国典型的有五指山猪、巴马猪、近交陆川猪、藏香猪、西藏小型猪、版纳微型猪、剑白香猪、蕨麻小型猪、乌金猪、合作猪等。然而有些小型猪品种的外形相似，或在培育过程中出现杂交繁育的现象，导致难以用肉眼依据表型进行品种的鉴别，急需科学的鉴别手段。目前，从基因角度鉴定植物或动物品种的研究很多，其中最为有效的方法是基于微卫星两端序列的保守性，设计特异性的引物进行品种鉴别。然而，由于猪基因组中微卫星的挖掘不够全面，只能利用其它物种的微卫星序列进行同源比较分析，设计的相应引物不具有品种间特异性，在进行品种鉴定时费时费力且结果不准确，限制了实验用小型猪品种的鉴定。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中实验用小型猪外形相似，肉眼难以鉴别的技术问题，目的在于提高一种利用基因技术手段鉴定实验用小型猪品种的方法。本专利技术的目的之一在于提供一种用于鉴定实验用小型猪品种的特异性微卫星引物组合物，所述引物组合物包括3对引物，具体为：如SEQIDNO:1所示的正向荧光引物F7：ATCCCCCACTCATTCTCACA；如SEQIDNO:2所示的反向普通引物R7：GCAAAACTGCACACAGCCTA；如SEQIDNO:3所示的正向荧光引物F9:TCCAGGCCCAGGTTGTATTA；如SEQIDNO:4所示的反向普通引物R9:AGGATCTTTTTCGGCAGGAT；如SEQIDNO:5所示的正向荧光引物F19:CAGCTTACAGCAAAAGTAGCCA；如SEQIDNO:6所示的反向普通引物R19:AAGATGTTTCATCAGACTATATCCGT。其中，F7、R7指7号微卫星座的正向引物和反向引物；F9、R9指9号微卫星座的正向引物和反向引物；F19、R19指19号微卫星座的正向引物和反向引物。也即，7号微卫星座的核苷酸序列是小型猪上位于正向引物F7核苷酸序列和反向引物R7核苷酸序列之间的一段核苷酸序列；9号微卫星座的核苷酸序列是小型猪上位于正向引物F9核苷酸序列和反向引物R9核苷酸序列之间的一段核苷酸序列；19号微卫星座的核苷酸序列是小型猪上位于正向引物F19核苷酸序列和反向引物R19核苷酸序列之间的一段核苷酸序列。其中，所述实验用小型猪品种为：五指山猪、巴马猪、近交陆川猪或藏香猪。本专利技术的方法可以鉴定任何生长阶段的实验用小型猪品种，主要包括：五指山猪、巴马猪、近交陆川猪和藏香猪，从基因角度入手，利用3对品种特异性的微卫星引物进行荧光引物PCR扩增、纯化、毛细管电泳及数据分析等过程，准确鉴定实验用小型猪品种。本专利技术的目的之二在于提供一种鉴定实验用小型猪品种的方法，具体包括如下步骤：步骤S1：采集待鉴定实验用小型猪个体的组织样品，进行DNA提取及质量检测；步骤S2：用权利要求1所述的用于鉴定实验用小型猪品种的特异性微卫星引物组合物进行PCR扩增得PCR扩增产物；步骤S3：取部分PCR扩增产物进行毛细管电泳，根据分子内标和HiDi确定相应位点的片段大小和信号值；步骤S4：依据待鉴定实验用小型猪个体在7、9和19号微卫星座位上的基因片段大小，统计相应等位基因和基因型，根据等位基因及基因型推算待鉴定实验用小型猪个体的品种。其中，步骤S4中得出的等位基因及基因型，依据以下标准鉴定实验用小型猪个体的品种：若待鉴定个体在7号微卫星座位上存在7G或7K等位基因，或在7号微卫星座位上存在特异基因型7F7K，或在9号微卫星座位上存在特异基因型9C9H或9E9H，或在19号微卫星座位上存在特异基因型19A19D或19C19D，则待鉴定个体为五指山猪；若待鉴定个体在7号微卫星座位存在7D或7J等位基因，或在7号微卫星座位上存在特异基因型7C7J或7F7J，或在19号微卫星座位上存在特异基因型19C19H，则待鉴定个体为巴马猪；若待鉴定个体在7号微卫星座位上存在7L等位基因，或在9号微卫星座位上存在9I等位基因，或在9号微卫星座位上存在特异基因型9B9I、9H9I或9I9I，或在19号微卫星座位上存在特异基因型19A19G、19A19H、19G19H或19H19H，则待鉴定个体为近交陆川猪；若待鉴定个体在7号微卫星座位上存在7A等位基因，或在9号微卫星座位上存在特异基因型9A9F、9E9F或9F9F，则待鉴定个体为藏香猪。其中，7号、9号、19号微卫星座对应片段大小与等位基因编号所述组织样品为猪耳朵组织样品。本专利技术的有益效果是，基于实验用小型猪种基因组中3对品种特异性的微卫星引物进行品种鉴定具有很高的准确性和可靠性，可以从分子层面鉴定任何生长阶段的实验用小型猪品种。此外，本专利技术优化的特异性微卫星引物鉴定的试验条件，提供了详细的操作流程及相应试剂和仪器，解决实验用小型猪的品种鉴定。本专利技术是基于小型猪种基因组中的微卫星序列，通过群体试验验证并筛选得到了实验用小型猪不同品种间特异的微卫星序列及引物，优化了所述引物的试验条件和使用方法，解决了实验用小型猪品种的鉴定。以下将对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。具体实施方式实施例1选取4个实验用小型猪品种(分别为五指山猪48头、巴马猪15头、近交陆川猪50头和藏香猪47头)共160头，分别采集每个个体耳组织样品置于装有75％乙醇的EP管中，采用酚氯仿方法进行基因组DNA提取，分别利用NanoDrop2000(美国ThermoFisherScientific公司)、1％的琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像(北京众力挽生物科技有限公司，NewbioGi-1)检测DNA浓度、OD值及DNA质量，对DNA浓度≥50ng/μL、OD260/280在1.6～1.8之间、琼脂糖凝胶电泳的成像为高亮条带的DNA进行如下操作。荧光引物及普通引物由上海派森诺生物科技股份有限公司合成，引物核酸序列见表1，PCR反应体系见表2，其中，DNA浓度为50ng/μL(稀释后浓度)，10×buffer、dNTP和Taq酶均购于宝生物工程(大连)有限公司，货号分别为：9153A、D4030A和DRR20AM，利用PCR仪(美国AppliedBiosystems公司，ABI-2720)分别对3对引物进行荧光引物PCR扩增，反应程序见表3。表1实验用小型猪品种特异的3对微卫星本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴定实验用小型猪品种的特异性微卫星引物组合物，其特征在于所述引物组合物包括3对引物，具体为：/n如SEQ ID NO:1所示的正向荧光引物F7：/nATCCCCCACTCATTCTCACA；/n如SEQ ID NO:2所示的反向普通引物R7：/nGCAAAACTGCACACAGCCTA；/n如SEQ ID NO:3所示的正向荧光引物F9:/nTCCAGGCCCAGGTTGTATTA；/n如SEQ ID NO:4所示的反向普通引物R9:/nAGGATCTTTTTCGGCAGGAT；/n如SEQ ID NO:5所示的正向荧光引物F19:/nCAGCTTACAGCAAAAGTAGCCA；/n如SEQ ID NO:6所示的反向普通引物R19:/nAAGATGTTTCATCAGACTATATCCGT。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定实验用小型猪品种的特异性微卫星引物组合物，其特征在于所述引物组合物包括3对引物，具体为：
如SEQIDNO:1所示的正向荧光引物F7：
ATCCCCCACTCATTCTCACA；
如SEQIDNO:2所示的反向普通引物R7：
GCAAAACTGCACACAGCCTA；
如SEQIDNO:3所示的正向荧光引物F9:
TCCAGGCCCAGGTTGTATTA；
如SEQIDNO:4所示的反向普通引物R9:
AGGATCTTTTTCGGCAGGAT；
如SEQIDNO:5所示的正向荧光引物F19:
CAGCTTACAGCAAAAGTAGCCA；
如SEQIDNO:6所示的反向普通引物R19:
AAGATGTTTCATCAGACTATATCCGT。


2.如权利要求1所述的用于鉴定实验用小型猪品种的特异性微卫星引物组合物，其特征在于所述实验用小型猪品种为：五指山猪、巴马猪、近交陆川猪或藏香猪。


3.一种鉴定实验用小型猪品种的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤S1：采集待鉴定实验用小型猪个体的组织样品，进行DNA提取及质量检测；
步骤S2：用权利要求1所述的用于鉴定实验用小型猪品种的特异性微卫星引物组合物进行PCR扩增得PCR扩增产物；
步骤S3：取部分PCR扩增产物进行毛细管电泳，根据分子内标和HiDi确定相应位点的片段大小和信号值；
步...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪洋，谈永松，涂尾龙，张莺莺，吴华莉，曹建国，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31