一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于PCR‑MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，过程包括：建立伊蚊种类鉴定基因数据库(COI，COII，28s，CytB400)、建立伊蚊种类鉴定DNA二维码、多重PCR‑MS引物设计及多重PCR‑MS质谱扫描；从九种伊蚊种类的数千条基因序列中，分析得到每个伊蚊种类特异性SNP位点。根据这些位点，对每个种类选用2个以上基因的特异性SNP位点，同时参考其它种类的特异性和非特异性位点作为排它法处理，设计分析软件通过对多个位点的碱基识别，确认其所属种类，提高了对伊蚊种类鉴别的准确度，避免了漏检。

A method for identification of Aedes species based on pcr-ms mass spectrometry

【技术实现步骤摘要】
一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法
本专利技术涉及基因工程
，更具体地说是涉及一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法。
技术介绍
蚊类能携带和传播多种病原微生物，精准鉴定蚊类对预防和控制蚊媒传染病有重要意义。白纹伊蚊和埃及伊蚊等伊蚊都是重要的蚊媒传染病传播媒介。白纹伊蚊在我国分布的范围较广，但随着环境条件变化及各地交通贸易的频繁，埃及伊蚊的分布范围也在逐渐扩大。准确鉴别白纹伊蚊和埃及伊蚊等伊蚊有利于更好地预防和控制蚊媒传染病。目前，形态学鉴定是蚊类鉴定的主要手段，但对于不完整个体、幼虫等样本鉴定困难。DNA条形码技术，可以有效鉴定蚊类属种，不但费时、费力，而且严重依赖DNA测序。因此，需要发展新的蚊类鉴定方法。PCR-MS质谱扫描技术，具有两大独特优势：不仅具有超高灵敏度，检测限≤10拷贝/反应；还同时具有超宽动态范围≥9个数量级。在单反应中确保几十个生物靶标，不论载量高低，从单个到千亿个分子，均可一次检出，由于检测通量高，采用双基因探针，能够有效避免漏检。目前，基于PCR-质谱扫描病原体技术已经成功用于人乳头瘤病毒双基因分型、冠状病毒、人肠道病毒等病原体分型检测。如能开发出伊蚊种类分型检测方法，对后续开展的蚊媒病原体检测，提供了同步检测的理想平台。因此，如何提供一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术利用PCR-MS质谱扫描方法，从九种伊蚊种类的数千条基因序列中，分析得到每个伊蚊种类特异性SNP位点。根据这些位点，对每个种类选用2个以上基因的特异性SNP位点，同时参考其它种类的特异性和非特异性位点作为排它法处理，设计分析软件通过对多个位点的碱基识别，确认其所属种类，提高了对伊蚊种类鉴别的准确度，避免了漏检。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，包括下述步骤：1)建立伊蚊基因数据库：通过BOLDSYSTEMSDNA条形码数据库和NCBIDNA数据库，获得伊蚊基因序列，包括COI、COⅡ、28s、CytB400基因；2)建立伊蚊DNA二维码：通过Sequencher5.3软件聚类分析伊蚊基因序列，选取种类特异性的单核苷酸多态性(SNP)为靶标，建立伊蚊DNA二维码分形图；3)多重PCR-MS引物设计：基于伊蚊DNA二维码分形图，使用MassARRAYAssayDesigner4.0软件，设计多重PCR特异性引物和探针；4)多重PCR-MS质谱扫描：提取待测伊蚊的基因组，并依次进行前PCR反应、SAP酶处理、单碱基延伸和质谱分析，得出待检测伊蚊的具体种类。以上技术方案达到的技术效果是：先从九种伊蚊种类的数千条基因序列中，分析得到每个伊蚊种类特异性SNP位点，然后针对每个靶点SNP设计一条延伸引物，在以ddNTPs为底物的体系中进行单碱基延伸，每个SNP的等位基因延伸产物仅为末端一个碱基的差异，以分子量为标记精确检测单点碱基，由此鉴别出四种不同种类的伊蚊；该方法相对于常规的测序方法，准确性高，且耗时短，作为本专利技术优选的技术方案，步骤4)中，以CompletePCRReagent试剂盒进行前PCR扩增，PCR扩增的体系为：H2OHPLCgrade1.3μL、10×PCRBuffer含20mMMgCl20.5μL、25mMMgCl20.4μL、25mMdNTPmix0.1μL、1μMPrimermix(所有的引物混合)0.5μL、5U/μLhotstarTaqpolymerase0.2μL、总体积3.0μL；作为本专利技术优选的技术方案，步骤4)中，以CompletePCRReagent试剂盒进行SAP酶消化，SAP酶处理的过程包括：步骤一取出PCR反应产物，4000rpm离心lmin；步骤二取出SAP反应试剂，试剂融化后，涡漩振荡20秒后掌式离心机离心lmin；步骤三配制SAP反应MIX：H2O(autoclaved)1.53μL、10×SAPBuffer0.17μL、1.7U/μLSAPenzyme0.30μL，总体积2μL；步骤四在384孔微量滴定板的每孔中加入2μL的SAP混合物，封口，混匀，并在4000rpm下离心1min；步骤五将离心后的滴定板在37℃40min；85℃5min下孵育，然后4℃保存。作为本专利技术优选的技术方案，以iPLEXProReagent试剂盒进行延伸反应，iPLEX延伸反应过程如下：步骤一取SAP反应产物，并在4000rpm下离心lmin；步骤二取出iPLEX延伸反应试剂，试剂融化后，振荡20s后掌式离心机离心1min；步骤三配制iPLEX延伸反应体系：H2O(HPLC级)0.619μL、10×iPLEXBufferPlus0.2μL、5μMiPLEXTerminationmix0.2μL、33U/μLiPLEXExtendPrimermix0.94μL、iPLEXProenzyme0.04μL、总体积2μL；步骤四在微量滴定板的每孔中加入iPLEX延伸反应混合物，封口、混匀，并在4000rpm下离心1min；步骤五延伸，程序为：作为本专利技术优选的技术方案，步骤4)中，以SpectroCHIPArrays和CleanResin试剂盒进行树脂纯化，过程如下：步骤一准备用于树脂纯化的dimple板、刮刀、长匙、树脂和纯水；步骤二涂布树脂；步骤三取iPLEX延伸反应产物，4000rpm离心1min，然后在每孔加入16μL水，封口，4000rpm离心30s；步骤四将步骤三所得样品板轻轻地倒放于dimple板上，使得树脂倒入样品板，并轻拍dimple板确保所有树脂掉下来，旋转、离心iPLEX反应产物。作为本专利技术优选的技术方案，步骤二中涂布树脂的过程为：(1)将约树脂转移到384孔dimple板上；(2)用刮刀来回刮动将树脂涂布于每个孔中；(3)回收多余的树脂，在室温下放置至树脂干燥。作为本专利技术优选的技术方案，步骤4)中，质谱的分析过程如下：步骤一以50％的乙醇清洗仪器；步骤二根据芯片使用情况和所编辑的反应板的位置，编辑mapping文件；步骤三选择384孔板点样条件点芯片；步骤四将编辑的反应板信息与质谱仪信息联系起来(质谱激光扫描联用多重PCR技术，是将多重PCR技术、质谱技术、芯片技术以及生物信息学方法结合于一体的技术。反应板跟质谱仪的信息对应是在电脑屏幕上操作的，这属于仪器操作SOP)；步骤五质谱分析和输出检测报告。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，在单碱基延伸过程中用两个及以上的SNP位点来识别一个种或者一个型别，根据每种种类的SNP位点设计探针，即UEP引物，当SNP位点与探针能够特异性结合时，可以对SNP位点的单碱基进行延伸；而且，本专利技术中设计的UEP引物序列长度均不同，每种伊蚊种类对应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，包括下述步骤：/n1)建立伊蚊基因数据库：通过BOLDSYSTEMSDNA条形码数据库和NCBIDNA数据库，获得伊蚊基因序列；/n2)建立伊蚊DNA二维码：通过Sequencher5.3软件聚类分析伊蚊基因序列，选取种类特异性的单核苷酸多态性(SNP)为靶标，建立伊蚊DNA二维码分形图；/n3)多重PCR-MS引物设计：基于伊蚊DNA二维码分形图，使用

【技术特征摘要】
1.一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)建立伊蚊基因数据库：通过BOLDSYSTEMSDNA条形码数据库和NCBIDNA数据库，获得伊蚊基因序列；
2)建立伊蚊DNA二维码：通过Sequencher5.3软件聚类分析伊蚊基因序列，选取种类特异性的单核苷酸多态性(SNP)为靶标，建立伊蚊DNA二维码分形图；
3)多重PCR-MS引物设计：基于伊蚊DNA二维码分形图，使用MassARRAYAssayDesigner4.0软件，设计多重PCR特异性引物和探针；
4)多重PCR-MS质谱扫描：提取待测伊蚊的基因组，并依次进行前PCR反应、SAP酶处理、单碱基延伸和质谱分析，得出待检测伊蚊的具体种类。


2.根据权利要求1所述的一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，步骤4)中，以CompletePCRReagent试剂盒进行前PCR扩增，PCR扩增的体系为：



反应程序为：





3.根据权利要求2所述的一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，步骤4)中，以CompletePCRReagent试剂盒进行SAP酶消化，SAP酶处理的过程包括：
步骤一取出PCR反应产物，4000rpm离心1min；
步骤二取出SAP反应试剂，试剂融化后，涡漩振荡20秒后掌式离心机离心1min；
步骤三配制SAP反应MIX：



步骤四在384孔微量滴定板的每孔中加入2μL的SAP混合物，封口，混匀，并在4000rpm下离心1min；
步骤五将离心后的滴定板在37℃40min；85℃5min下孵育，然后4℃保存。


4.根据权利要求3所述的一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹晓梅，张晓龙，杨宇，李颖，刘莹莹，王怀远，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11