一种检测日本吸血虫的荧光RAA引物、探针及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测日本吸血虫的荧光RAA引物、探针及检测方法，属于体外核酸检测领域，所述引物对的正向引物的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2所示；所述探针为寡核苷酸探针，序列信息如SEQ ID NO.3所示；一种基于RAA荧光检测日本吸血虫的试剂盒，包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括所述的引物对和所述的探针；检测方法可以实现单管快速检测日本血吸虫，全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；不依赖于PCR等贵重仪器，甚至能在39℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；可以快速、定性检测血吸虫体及虫卵。

A fluorescent RAA primer, probe and detection method for the detection of Haemophilus japonicus

【技术实现步骤摘要】
一种检测日本吸血虫的荧光RAA引物、探针及检测方法
本专利技术属于体外核酸检测领域，具体涉及一种检测日本吸血虫的荧光RAA引物、探针及检测方法。
技术介绍
日本血吸虫(SchistosomajaponicumKatsurada，1904)即血吸虫，又称裂体吸虫。血吸虫病是由血吸虫寄生于人体引起的地方性寄生虫病。寄生于人体的血吸虫主要有三种：即流行于非洲北部的埃及血吸虫，流行于拉丁美洲及非洲中部的曼氏血吸虫以及流行于亚洲的日本血吸虫。此外，还有间插血吸虫、湄公血吸虫可以寄生人体。在我国因只有日本血吸虫病流行，故通常将日本血吸虫病简称为血吸虫病。血吸虫病是一种人兽共患寄生虫病，是被WHO列为极易复现和再现的被忽视热带病之一。随着我国血吸虫病防治进程的逐步深入，低流行态势下血吸虫病防治工作的开展有赖于敏感高效的监测预警体系。血吸虫尾蚴，童虫和虫卵对宿主产生机械性损伤，并引起复杂的免疫病理反应。尾蚴穿透皮肤时引起皮炎，皮炎仅发生于曾感染过尾蚴的人群，是一种速发型和迟发型变态反应。尾蚴性皮炎对童虫在皮肤内的破损有一定的促进作用，是宿主的获得性免疫对再感染的反应。童虫在体内移行时，对所经过的器官，主要是肺脏，引起血管炎，毛细血管栓塞、破裂，出现局部细胞浸润和点状出血。患者可表现为咳嗽、咯血、发热，嗜酸性粒细胞增多等。诊断是血吸虫病防治工作的中心环节。化疗对象的确定及化疗效果评价，防治活动计划、实施和防治效果评价等血吸虫病防治工作的各个环节都需要诊断提供必要的信息和依据。虽然目前已有多种病原学和免疫学技术应用于日本血吸虫感染检测，但在早期诊断及检测敏感性和特异性方面不甚理想。传统的检测方法主要是进行形态检查，主观性较强，需要实验人员一定的经验，因此往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在症状时期检测到虫卵的感染，并且快速灵敏，目前应用于血吸虫的检测。目前，国内外已建立的血吸虫检测方法有实时PCR检测方法、半巢式PCR检测方法、LAMP检测方法等，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，而LAMP方法引物较复杂，必须用特殊的软件设计，且用LAMP方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种检测日本吸血虫的荧光RAA引物、探针及检测方法，以解决上述PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，LAMP方法引物较复杂，且只能用于判断目的基因的存在，无法直接克隆和测序缺陷。本专利技术采用的技术方案如下：一种基于RAA荧光检测日本吸血虫的引物对和探针，其特征在于：所述引物对的正向引物的核苷酸序列信息如SEQIDNO.1所示，5'-CATTGTGTGAGCAGCCAGGAAGTGACAATC-3'，反向引物的核苷酸序列信息如SEQIDNO.2所示，5'-CTATATTAGAGGCGTGAGGTTATACAGTTA-3'；所述探针为寡核苷酸探针，序列信息如SEQIDNO.3所示，5'-CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAG/FAM-Dt//THF//BHQ-dT/CACCATCAACTCTTA//phosphate/-3'，其中，其中，FAM-dT表示T碱基修饰羧基荧光素，THF表示C碱基修饰四氢呋喃基团并取代C碱基，BHQ-dT表示T碱基修饰黑洞淬灭基团，phosphate表示3'进行磷酸化终止阻断。寡核苷酸探针：5'-CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAG(FAM-dT)(THF)(BHQ-dT)CACCATCAACTCTTA(phosphate)-3'；其中：FAM：6-Carboxyfluorescein；THF：tetrahydrofuran；BHQ:blackholequencher；phosphate:3’phosphatetoblockelongation。本专利技术的技术方案是针对于血吸虫SjG28基因的特异保守区域为靶标区域，设计特异性引物及荧光RAA探针。一种基于RAA荧光检测日本吸血虫的试剂盒，包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括所述的引物对和所述的探针，其中，正向引物、反向引物和探针的体积比为3.5:3.5:1。一种基于RAA荧光检测日本吸血虫的检测方法，包括如下步骤：(a)提取待检测样本DNA；(b)配制RAA反应体系，按体积份数计总体系50份，包括反应缓冲液25份，正向引物、反向引物各2.1份，探针0.6份，双蒸水16.7份，将上述46.5份混合液加入荧光基础反应单元中，加入醋酸镁2.5份，待检测样本DNA模板1份；(c)RAA反应体系扩增提取待检测样品的DNA作为模板进行RAA反应，反应条件为在39℃下恒温扩增20min；(d)结果判定标准：阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，则实验数据有效，否则实验结果视为无效；结果描述及判定：无扩增曲线，样品判为阴性，出现扩增曲线，样品判为阳性。更为优选的，(d)结果判定标准：阴性对照：FAM通道无扩增曲线，且无Tt值；阳性对照：FAM通道有扩增曲线，Tt值均≤8min，以上两个要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。结果描述及判定：当FAM通道均有扩增曲线，质量控制正常时，可判定血吸虫核酸阳性；当FAM通道无扩增曲线，且Tt值显示为Undet或NoTt，质量控制正常时，可判定血吸虫核酸阴性。优选的，步骤(a)中待检测样本包括血液、组织、细胞或粪便，DNA提取后进行分装备用，冻存于-80℃，血液、组织或细胞基因组DNA提取试剂盒、粪便基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司。优选的，步骤(b)中正向引物、反向引物及探针的浓度均为10pmol/uL。一种所述的引物对和探针或所述的试剂盒在检测日本吸血虫的应用。本申请的技术方案中：在RAA反应过程中，血吸虫RNA通过利用重组酶代替PCR高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止DNA链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以DNA为模板合成目的产物，反应在39℃下进行20分钟。此外，RAA技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套RAA多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式PCR技术无法相比的。再者，RAA技术不依赖于PCR仪器的便捷性能，且检测时间较PCR方法或荧光荧光PCR显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至高于，是革命性的技术突破，能充分扩大核酸扩增技术的应用领域。本申请的技术方案中，序列表中，正向引物的序列：5'-cattgtgtgagcagccaggaagtgacaatc-3'(30bp)；反向引物的序列：5'-ctatattagaggcgtgaggttatacagtta-3'(30bp)；未经修饰的探针序列为：cataggaggtcatct本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于RAA荧光检测日本吸血虫的引物对和探针，其特征在于：所述引物对的正向引物的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示，5'-CATTGTGTGAGCAGCCAGGAAGTGACAATC-3'，反向引物的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2所示，5'-CTATATTAGAGGCGTGAGGTTATACAGTTA-3'；所述探针为寡核苷酸探针，序列信息如SEQ ID NO.3所示，5'-CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAG/FAM-dT//THF//BHQ-dT/CACCATCAACTCTTA//phosphate/-3'，其中，FAM-dT表示T碱基修饰羧基荧光素，THF表示C碱基修饰四氢呋喃基团并取代C碱基，BHQ-dT表示T碱基修饰黑洞淬灭基团，phosphate表示3'进行磷酸化终止阻断。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于RAA荧光检测日本吸血虫的引物对和探针，其特征在于：所述引物对的正向引物的核苷酸序列信息如SEQIDNO.1所示，5'-CATTGTGTGAGCAGCCAGGAAGTGACAATC-3'，反向引物的核苷酸序列信息如SEQIDNO.2所示，5'-CTATATTAGAGGCGTGAGGTTATACAGTTA-3'；所述探针为寡核苷酸探针，序列信息如SEQIDNO.3所示，5'-CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAG/FAM-dT//THF//BHQ-dT/CACCATCAACTCTTA//phosphate/-3'，其中，FAM-dT表示T碱基修饰羧基荧光素，THF表示C碱基修饰四氢呋喃基团并取代C碱基，BHQ-dT表示T碱基修饰黑洞淬灭基团，phosphate表示3'进行磷酸化终止阻断。


2.一种基于RAA荧光检测日本吸血虫的试剂盒，其特征在于：包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括权利要求1所述的引物对和所述的探针。


3.一种基于RAA荧光检测日本吸血虫的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：田绿波，何纬，王俊贤，石莹，
申请(专利权)人：四川国际旅行卫生保健中心成都海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：四川;51