一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法及应用技术方案

本发明专利技术涉及一种基于CRISPR‑Cas13a检测微生物的方法，首先对待测细菌进行前处理，提取其基因组，通过PCR扩增以及体外转录两步得到RNA，称作target RNA。当target RNA存在时可以激发Cas13a‑crRNA复合物的附属切割能力，即切割无关单链RNA。在此RNA一端修饰荧光基团，另一端修饰淬灭基团。当Cas13a‑crRNA复合物检测到相应的Target RNA时，能够切割荧光探针，导致荧光值增加，荧光值的增长与待测细菌存在线性对应关系，利用此来检测微生物。本方法具有出色的可靠性、极高的灵敏性、高度的特异性、易于实施和检测所需时间短的特点，其对微生物的检测具有巨大潜力。

A method of microbial detection based on crispr-cas13a system and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法及应用
本专利技术属于食品安全检测生物
，尤其是一种基于CRISPR-Cas13a系统灵敏、特异性的检测金黄色葡萄球菌的方法及应用。
技术介绍
进入21世纪以来，食源性疾病已成为影响公众健康的重要因素，根据世界卫生组织(WHO)统计，全球每年有近15亿人感染食源性疾病，其中70％是由食品中致病微生物污染引起的。江南大学食品安全风险治理研究院联合多家大学发布的《中国食品安全发展报告(2018)》指出，目前我国食品安全还存在四大主要风险，其中微生物污染问题最为严重，占抽检发现的不合格样品总量的32.74％，较2016年上升了4.84％。食品安全问题备受各级政府、学术界和民间的重视。致病微生物由于个体微小，世代时间非常短，能够通过形成菌膜等方式逃脱消毒剂和杀菌剂等消杀处理，因此分布很广。其中由于致病菌引起的污染在食品污染中最为常见，常见的致病菌有沙门氏菌、弯曲菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、肉毒梭菌、单核细胞增生李斯特菌以及致病性大肠杆菌等。为了防止疾病暴发并为消费者提供安全的食物，需要快速灵敏地检测食品中的致病微生物含量。传统检测方法依赖于微生物培养，然后进行生化鉴定和抗菌药敏试验。然而，这种方法耗时、周期长，一般要经过前增菌、选择性增菌、选择性平板分离、生化鉴定、血清学鉴定5个步骤，往往需要4到7天，甚至更长时间才能做出最终鉴定。近年来兴起的方法，如基因测序、NMR(核磁共振)、MS(质谱)、DNA微阵列、组学方法等需要大型昂贵仪器，实验周期长，不利于快速现场即时检验。此外，基于抗原-抗体反应的免疫学方法也层出不穷，并且部分已经应用到实际，但其也存在成本高，抗体制备周期长，某些剧毒性物质不能够通过免疫动物的方式制备抗体，交叉反应性带来的假阳性、抗体的不稳定性等诸多困扰。因此开发能够平衡快速、靶向、可视化、集成化、高精准度、高特异性、搭建周期短等特点的新型食品安全检测体系迫在眉睫。微生物簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关的(CRISPR-Cas)自适应免疫系统是细菌和古细菌在与噬菌体的生存斗争中进化出的获得性免疫系统。最近，CRISPR-Cas系统由于其除了能进行crRNA介导的目标核酸切割之外(cis-cleavage)，还具有目标切割激活的核酸附属切割活性(又称trans-cleavage)，因此作为用于核酸靶向的快速、精确和强大的检测平台而受到欢迎。Zhang等人将Cas13a的附带效应与等温扩增相结合，建立了基于CRISPR的诊断程序，并形成了特异性高灵敏度酶报告基因解锁(SHERLOCK)平台，从而以对摩尔的敏感性和单碱基错配特异性成功检测出Zika和登革热病毒的特定菌株。此外，CRISPR-Cas13a还被用于检测高浓度的禽流感A(H7N9)病毒，埃博拉病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、microRNA和植物基因等。通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术环境压力胁迫问题的不足之处，提供一种基于CRISPR-Cas13a系统灵敏、特异性的检测微生物的方法及应用，该方法能够检测微生物的基因组DNA(gDNA)浓度，特别是金黄色葡萄球菌。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，所述方法通过两步扩增即PCR扩增以及将PCR产物进行转录扩增得到RNA，称其为targetRNA，即目标RNA，设计crRNA的核酸序列，利用Cas13a-crRNA复合物检测targetRNA；具体的步骤为：targetRNA存在时能够激发Cas13a-crRNA复合物的核酸特异性识别引发的附属切割能力，即切割无关单链RNA；在此情况下，若选择合成一条RNA，将其一端修饰荧光基团，另外一端修饰淬灭基团，制备成reporterRNA，即报告RNA，reporterRNA就能被Cas13a酶切，产生增强的荧光信号进行输出；此荧光信号的变化和待检测细菌的浓度能够成线性关系，能够检测和定量细菌。而且，通过两步扩增待检测细菌的DNA来得到targetRNA，当Cas13a-crRNA检测到相应的targetRNA时，即targetRNA和crRNA能够互补配对，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM脱离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加能够与微生物浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定细菌；或者，所述方法检测限为2CFU/mL；检测动态区间为100到107CFU/mL；检测所需时间从样品制备直到得到结果总共需要3-4小时。而且，步骤如下：⑴样品简单前处理，裂解微生物细胞，释放基因组DNA(gDNA)；⑵PCR扩增，对微生物特异性基因片段进行扩增；⑶体外转录，将扩增后的DNA转录为RNA，即为targetRNA；⑷荧光检测，即可检测目的基因组微生物DNA浓度。而且，所述步骤⑵中微生物特异性基因片段为金葡菌的nuc基因。而且，所述crRNA的核苷酸序列为SEQNO.1，所述TargetRNA的核苷酸序列为SEQNO.2，PCR引物序列分别为SEQNO.3和SEQNO.4，所述reporterRNA核苷酸序列为SEQNO.5。而且，所述微生物为金黄色葡萄球菌。而且，具体步骤如下：⑴蛋白表达：取转化表达质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a到2(DE3)PlysS感受态细胞中，涂布至含有200μg/mL氨苄霉素的LB平板，用于蛋白表达；挑取单菌落至含有200μg/mL氨苄霉素的50mLLB培养基中，37℃，140rpm培养过夜；按1：50接种新鲜的LB液体培养基中，该培养基含Amp200μg/mL，于37℃，140rpm培养2-4h，当OD600＝0.6～0.8时加入终浓度为0.5mM的异丙基-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，于16℃，120rpm条件下诱导表达26h；将诱导后的菌液4℃，8000rpm离心15min，弃上清，-20℃保存；⑵蛋白纯化：纯化过程均在4℃下进行；在收集到的菌体中加入裂解缓冲液重悬菌体，加入蛋白酶抑制剂1mM和溶菌酶0.5mg/mL，4℃冰浴30min后进行超声破碎，具体条件为：Φ6变幅杆，P＝30％，开3s，关7s；将破碎后得到的样品于4℃20000×g离心30min，上清液使用0.4μm滤膜过滤；将过滤得到的上清加入到含NiSepharose6FF的50mL离心管中，晃动混匀，在4℃滚轴上孵育3h，使His-tag蛋白与Ni-beads充分结合；用洗涤缓冲液洗涤蛋白质结合的Ni-beads，并用洗脱缓冲液洗脱；将洗脱的蛋白质用缓冲液透析，并用Millipore超滤管浓缩；测定蛋白浓度最终保存于-80℃备用；其中，所述裂解缓冲液的配方为：50mMNa-P，pH8.0,0.3MNaCl,2mMDTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：所述方法通过两步扩增即PCR扩增以及将PCR产物进行转录扩增得到RNA，称其为target RNA，即目标RNA，设计crRNA的核酸序列，利用Cas13a-crRNA复合物检测target RNA；/n具体的步骤为：target RNA存在时能够激发Cas13a-crRNA复合物的核酸特异性识别引发的附属切割能力，即切割无关单链RNA；在此情况下，若选择合成一条RNA，将其一端修饰荧光基团，另外一端修饰淬灭基团，制备成reporter RNA，即报告RNA，reporter RNA就能被Cas13a酶切，产生增强的荧光信号进行输出；此荧光信号的变化和待检测细菌的浓度能够成线性关系，能够检测和定量细菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：所述方法通过两步扩增即PCR扩增以及将PCR产物进行转录扩增得到RNA，称其为targetRNA，即目标RNA，设计crRNA的核酸序列，利用Cas13a-crRNA复合物检测targetRNA；
具体的步骤为：targetRNA存在时能够激发Cas13a-crRNA复合物的核酸特异性识别引发的附属切割能力，即切割无关单链RNA；在此情况下，若选择合成一条RNA，将其一端修饰荧光基团，另外一端修饰淬灭基团，制备成reporterRNA，即报告RNA，reporterRNA就能被Cas13a酶切，产生增强的荧光信号进行输出；此荧光信号的变化和待检测细菌的浓度能够成线性关系，能够检测和定量细菌。


2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：通过两步扩增待检测细菌的DNA来得到targetRNA，当Cas13a-crRNA检测到相应的targetRNA时，即targetRNA和crRNA能够互补配对，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM脱离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加能够与微生物浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定细菌；
或者，所述方法检测限为2CFU/mL；检测动态区间为100到107CFU/mL；检测所需时间从样品制备直到得到结果总共需要3-4小时。


3.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴样品简单前处理，裂解微生物细胞，释放基因组DNA(gDNA)；
⑵PCR扩增，对微生物特异性基因片段进行扩增；
⑶体外转录，将扩增后的DNA转录为RNA，即为targetRNA；
⑷荧光检测，即可检测目的基因组微生物DNA浓度。


4.根据权利要求3所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：所述步骤⑵中微生物特异性基因片段为金葡菌的nuc基因。


5.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：所述crRNA的核苷酸序列为SEQNO.1，所述TargetRNA的核苷酸序列为SEQNO.2，PCR引物序列分别为SEQNO.3和SEQNO.4，所述reporterRNA核苷酸序列为SEQNO.5。


6.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：所述微生物为金黄色葡萄球菌。


7.根据权利要求6所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：具体步骤如下：
⑴蛋白表达：
取转化表达质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a到2(DE3)PlysS感受态细胞中，涂布至含有200μg/mL氨苄霉素的LB平板，用于蛋白表达；挑取单菌落至含有200μg/mL氨苄霉素的50mLLB培养基中，37℃，140rpm培养过夜；按1：50接种新鲜的LB液体培养基中，该培养基含Amp200μg/mL，于37℃，140rpm培养2-4h，当OD600＝0.6～0.8时加入终浓度为0.5mM的异丙基-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，于16℃，120rpm条件下诱导表达26h；将诱导后的菌液4℃，8000rpm离心15min，弃上清，-20℃保存；
⑵蛋白纯化：
纯化过程均在4℃下进行；在收集到的菌体中加入裂解缓冲液重悬菌体，加入蛋白酶抑制剂1mM和溶菌酶0.5mg/mL，4℃冰浴30min后进行超声破碎，具体条件为：Φ6变幅杆，P＝30％，开3s，关7s；将破碎后得到的样品于4℃20000×g离心30min，上清液使用0.4μm滤膜过滤；将过滤得到的上清加入到含NiSepharose6FF的50mL离心管中，晃动混匀，在4℃滚轴上孵育3h，使His-tag蛋白与...

【专利技术属性】
技术研发人员：马龙，满淑丽，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12