基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，属于病原体检测和诊断技术领域。包括以下步骤：引物设计;微流控芯片制作;恒温扩增反应体系配制;芯片加样;核酸扩增和结果判读。本发明专利技术采用恒温扩增技术和微流控芯片技术，利用具有链置换功能的聚合酶在63℃恒温条件下进行反应，使用荧光染料掺入法进行实时荧光检测，扩增阳性的样品会产生类似实时荧光的“S”形扩增曲线。成功制备的四种生殖道支原体的微流控芯片具有较好的灵敏度、特异性和准确性，整个检测过程在1h内即可完成。Uu、Mg、Mh的最低检测限为1000拷贝/μL，而Up的最低检测限为5000拷贝/μL,在临床上具有广泛的应用前景。

Detection of Mycoplasma in genital tract based on loop mediated constant temperature amplification and microfluidic chip

【技术实现步骤摘要】
基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法
本专利技术涉及病原体检测和诊断
，尤其涉及一种基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法。
技术介绍
支原体是一类大小介于细菌与病毒之间、缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物。目前已发现与生殖道感染有关的支原体主要有解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum，Uu)、微小脲原体(Ureaplasmaparvum，Up)，人型支原体(Mycoplasmahominis，Mh)、生殖支原体(Mycoplasmagenitalium，Mg)。液体培养法是前国内医疗机构对Uu和Mh的主要检测手段，该法具有操作简便，快速经济，肉眼即可观察，同时进行多种抗生素药敏试验的优点。但该法可能会受到细菌或真菌的污染造成假阳性，或标本中混有的产酸微生物对pH的改变产生干扰造成假阴性。Up和Mg在体外分离培养难度大，在液体培养基中不生长，在固体培养基上菌落大小极不一致，因此不推荐使用培养方法，目前主要靠DNA探针和PCR技术进行检测。血清学检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)引物设计；从公共数据库中获得Uu、Up、Mh、Mg四种支原体的功能基因序列，用Muscle进行多序列比对，结合工具得到consensus序列；以consensus序列为输入，结合工具剪切得到满足要求的引物序列；以剪切得到的引物序列做blast比对，结合工具得到初步的引物筛选结果，利用公共数据库进行进一步的引物筛选和特异性检测，得到最后的引物集；/n(2)微流控芯片制作；所述微流控芯片为碟式芯片，所述芯片固定有步骤（1）所述的生殖道支原体引物；/n(3)恒温扩增反应体系配制；将恒温扩增试剂于室温解冻、融化...

【技术特征摘要】
1.基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)引物设计；从公共数据库中获得Uu、Up、Mh、Mg四种支原体的功能基因序列，用Muscle进行多序列比对，结合工具得到consensus序列；以consensus序列为输入，结合工具剪切得到满足要求的引物序列；以剪切得到的引物序列做blast比对，结合工具得到初步的引物筛选结果，利用公共数据库进行进一步的引物筛选和特异性检测，得到最后的引物集；
(2)微流控芯片制作；所述微流控芯片为碟式芯片，所述芯片固定有步骤（1）所述的生殖道支原体引物；
(3)恒温扩增反应体系配制；将恒温扩增试剂于室温解冻、融化，摇匀并离心；在体系区，吸取9.0μL恒温扩增试剂加入200μL离心管中，并移至PCR模板加样区；在PCR模板加样区，加入9.0μL被检样品或者对照品的DNA，摇匀并离心；
(4)芯片加样；在模板区，从试剂盒中取出芯片使其恢复至室温，用移液器吸取18.0μL步骤（3）配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口加入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道即停止加样，并用封口膜封住进出样口，将加样后的芯片固定在低速离心机上，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张薇，
申请(专利权)人：重庆市第四人民医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50