本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物及其应用。本发明专利技术主要目的是针对副干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌亲缘性较高，普通引物特异性较差，容易产生假阳性的现状，本发明专利技术提供一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物，用于检测鉴定副干酪乳杆菌的特异引物对；提供利用这对引物对待测菌株进行特异性PCR扩增鉴定副干酪乳杆菌的方法；该检测副干酪乳杆菌的方法检测速度快、灵敏度高、特异性强。
A specific primer for amplification of Lactobacillus paracasei and its application
【技术实现步骤摘要】
一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物及其应用
本专利技术属于生物
，本专利技术涉及一种用于扩增副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)的特异性引物及其应用。
技术介绍
乳酸菌是发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰染色阳性细菌的总称。乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌，它能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。而在体外研究中发现，依靠细胞的应急和pH环境条件，乳酸菌可以吸收基因毒性和致癌原。副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)是一种兼性厌氧、不运动、无芽孢的杆菌或长杆菌，单个或成对出现，也有部分菌株排列成短链；属革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性。副干酪乳杆菌对很多细菌有拮抗作用，有的菌株还可抑制酵母及霉菌的生长。同时副干酪乳杆菌具有良好的生理作用，副干酪乳杆菌可增强宿主对微生物病原体的非特异性抵抗力，加快肠道内病原体的清除；能够治疗肠道菌群紊乱和肠道通透性增强，从而防止食物过敏和急性腹泻；使抗低密度氧化脂抗体和cD4T-淋巴细胞增加，粒细胞的噬菌作用明显增强，对宿主进行免疫调节，防止肿瘤的产生。乳杆菌群中的干酪乳杆菌群数量较多，其中副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及干酪乳杆菌三种菌亲缘结构相近，很难利用传统的方法进行区分。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术主要目的是针对副干酪乳杆菌与其他乳酸菌亲缘性较高，普通引物特异性较差，容易产生假阳性的现状，本专利技术提供一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物，用于检测鉴定副干酪乳杆菌的特异引物对；提供利用这对引物对待测菌株进行特异性PCR扩增鉴定副干酪乳杆菌的方法；该检测副干酪乳杆菌的方法检测速度快、灵敏度高、特异性强。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物；是一种用于检测副干酪乳杆菌的特异引物对；本专利技术利用已公布的副干酪乳杆菌tuf基因核酸序列为目标模板序列，利用DNAMAN进行比对筛选出保守序列，再利用IDT(引物设计软件)设计一对副干酪乳杆菌种特异性引物，设计出的引物对在Genbank数据库中检测引物特异性，合成引物。用于检测解副干酪乳杆菌的引物对序列如下所示：正向引物(ZF)：5’-CCTGGTGATGATATTCCTGTTATCC-3’；反向引物(ZR)：5’-TGTCTGTTTCACGAACAGGTG-3’。利用这对引物对待测菌株进行特异PCR扩增鉴定副干酪乳杆菌的方法，具体步骤如下：(1)固体样品总DNA的提取(预处理+试剂盒)：将需要检测的0.3-0.4g固体样品置于30mL离心管中，加入0.1mol/LPBS缓冲液振荡洗涤，200×g/4min离心，收集上清于新的离心管中(对装有样品的离心管重复洗涤操作三次，200×g/4min离心，收集上清于新管中)，弃上清保留菌体沉淀，并将三管合并于一管；向含有菌体沉淀的离心管中加入1mL65℃预热的BufferSCL裂解液，并加入1mL10mg/mL的溶菌酶65℃水浴10min；水浴完成后于12000rpm/3min室温离心，吸取300-350μL上清液至一个干净的1.5mL离心管中(吸取的上清一般呈黄色或深棕色)；加入等体积的BufferSP，上下颠倒混匀10次，冰浴10min(加入BufferSP混匀后溶液呈白色浑浊状)；12000rpm/3min离心，吸上清至干净的1.5mL离心管中；向离心管中加入200μL氯仿，充分混匀，12000rpm/5min离心，取上层水相至一个干净的离心管中；加入1.5倍体积的BufferSB，充分混匀后用移液器将其全部加入至吸附柱中，12000/rpm30s，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放回收集管中，加入700μLWashSolution，12000rpm/30s，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放回收集管中，加入300μLWashSolution，12000rpm/1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管中，12000rpm/2min；取出吸附柱，放入一个新的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入50-100μLTEBuffer，静置3min，12000rpm/2min离心，得到的DNA溶液采用核酸微量测定仪检测浓度及纯度，将DNA模板溶液于﹣20℃保存，于样品检测备用；液体样品总DNA的提取(预处理+试剂盒)：将需要检测的液体1mL样品置于2mL离心管中，200×g/4min离心，弃上清保留菌体沉淀，并将三管合并于一管；向含有菌体沉淀的离心管中加入1mL65℃预热的BufferSCL裂解液，并加入1mL10mg/mL的溶菌酶65℃水浴10min；水浴完成后于12000rpm/3min室温离心，吸取300-350μL上清液至一个干净的1.5mL离心管中(吸取的上清一般呈黄色或深棕色)；加入等体积的BufferSP，上下颠倒混匀10次，冰浴10min(加入BufferSP混匀后溶液呈白色浑浊状)；12000rpm/3min离心，吸上清至干净的1.5mL离心管中；向离心管中加入200μL氯仿，充分混匀，12000rpm/5min离心，取上层水相至一个干净的离心管中；加入1.5倍体积的BufferSB，充分混匀后用移液器将其全部加入至吸附柱中，12000/rpm30s，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放回收集管中，加入700μLWashSolution，12000rpm/30s，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放回收集管中，加入300μLWashSolution，12000rpm/1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管中，12000rpm/2min；取出吸附柱，放入一个新的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入50-100μLTEBuffer，静置3min，12000rpm/2min离心，得到的DNA溶液采用核酸微量测定仪检测浓度及纯度，并于﹣20℃保存，于样品检测备用；采用试剂盒为Ezup柱式土壤DNA抽提试剂盒，型号：B518263-0050。(2)PCR扩增：PCR扩增反应体系为：10×Buffer5μL，dNTP4μL，正向引物1μL，反向引物1μL，DNA模板1μL，rTaq酶0.5μL，ddH2O补足50μL。PCR扩增反应程序为：预变性95℃5min；变性94℃30S，58℃40s，72℃1min，35个循环；72℃7min；4℃保温。(3)琼脂糖凝胶电泳检测：PCR扩增产物采用2％琼脂糖凝胶电泳检测。将步骤(2)扩增出的产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳产物在紫外凝胶成像仪下进行观察，通过是否在136bp处出现条带来判断结果。采用引物gyrZF/gyrZR进行PCR，若有136bp核酸片段，则说明待测样品中存在副干酪乳杆菌(Lactobacillu本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物，其特征是，是一种用于检测副干酪乳杆菌的特异引物对；/n用于检测解副干酪乳杆菌的引物对序列如下所示：/n正向引物(ZF)：5’-CCTGGTGATGATATTCCTGTTATCC-3’；/n反向引物(ZR)：5’-TGTCTGTTTCACGAACAGGTG-3’。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物，其特征是，是一种用于检测副干酪乳杆菌的特异引物对；
用于检测解副干酪乳杆菌的引物对序列如下所示：
正向引物(ZF)：5’-CCTGGTGATGATATTCCTGTTATCC-3’；
反向引物(ZR)：5’-TGTCTGTTTCACGAACAGGTG-3’。
2.如权利要求1所述的一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物鉴定副干酪乳杆菌的方法，其特征是，
具体步骤如下：
(1)固体样品总DNA的提取：将需检测的0.3-0.4g固体样品置于30mL离心管中，加入0.1mol/LPBS缓冲液振荡洗涤，对装有样品的离心管重复洗涤操作三次，200×g/4min离心，收集上清于新管中，弃上清保留菌体沉淀，并将三管合并于一管；向含有菌体沉淀的离心管中加入1mL65℃预热的BufferSCL裂解液，并加入1mL10mg/mL的溶菌酶65℃水浴10min；水浴完成后于12000rpm/3min室温离心，吸取300-350μL上清液至一个干净的1.5mL离心管中；加入等体积的BufferSP，上下颠倒混匀10次，冰浴10min，加入BufferSP混匀后溶液呈白色浑浊状；12000rpm/3min离心，吸上清至干净的1.5mL离心管中；向离心管中加入200μL氯仿，充分混匀，12000rpm/5min离心，取上层水相至一个干净的离心管中；加入1.5倍体积的BufferSB，充分混匀后用移液器将其全部加入至吸附柱中，12000/rpm30s，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放回收集管中，加入700μLWashSolution，12000rpm/30s，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放回收集管中，加入300μLWashSolution，12000rpm/1min，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放回收集管中，12000rpm/2min；取出吸附柱，放入一个新的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入50-100μLTEBuffer，静置3min，12000rpm/2min离心，得到的DNA溶液采用核酸微量测定仪检测浓度及纯度，将DNA模板溶液于﹣20℃保存，于样品检测备用；
液体样品总DNA的提取：将需要检测的液体1mL样品置于2mL离心管中，200×g/4min离心，弃上清保留菌体沉淀，并将三管合并于一管；向含有菌体沉淀的离心管中加入1mL65℃预热的B...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔京春，曾诗娴，杨湘黔，成丽，张珂彬，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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