一种检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法及其应用。本发明专利技术以待测公羊全基因组DNA为模板，分别利用雄性特异性的qPCR引物对P1和P2扩增公羊PRAMEY基因和DDX3Y基因的部分片段，其中多拷贝PRAMEY基因作为检测基因，单拷贝DDX3Y基因作为参照基因，根据定量结果计算公羊PRAMEY基因的拷贝数。本发明专利技术方法简单、快速，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法及其应用
本专利技术属于分子遗传学检测领域，具体涉及一种检测公羊Y染色体PRAMEY基因(Preferentiallyexpressedantigeninmelanoma,Y-linked)拷贝数变异的方法，该方法利用qPCR技术，以DDX3Y基因(DEAD-BoxHelicase3Y-Linked)为参照，采用校正样本的绝对定量的方法计算公羊样本PRAMEY基因的拷贝数。
技术介绍
随着人们对基因组的不断深入研究，基因组结构变异越来越受到学者们的重视。Y染色体为雄性特有的染色体，在遗传育种方面有重要作用。目前已在Y染色体上发现至少3种多态类型：单核苷酸多态和插入/缺失、Y染色体短串联重复序列(ShorttandemrepeatontheYchromosome，STR)和基因拷贝数变异(Copynumbervariation，CNV)。基因拷贝数变异，主要指1Kb～5Mb的DNA片段的插入和缺失。通过结合CNVs和SNPs可以为羊种全基因组关联性分析(GWAS)选择重要经济性状的候选基因提供有力支撑，从而加快育种进程和提高遗传改良效果。哺乳动物的性染色体是由一对常染色体进化而来，其中Y染色体是所有染色体中最小的染色体，同时它也是雄性动物特有的性染色体。Y染色体主要由两部分组成：拟常染色体区(PAR)和雄性特异区(MSY)。许多多拷贝基因家族，如HSFY、TSPY、ZNF280AY、PRAMEY、PRAMEY等均存在于牛科动物Y染色体雄性特异区，这些多拷贝基因家族在进化过程中大量扩增，并在睾丸组织中主要或者特异性表达。总的来说，Y染色体与雄性生殖功能密切相关。多拷贝基因家族在哺乳动物Y染色体的雄性特异区(MSY)中尤其普遍，不同动物Y染色体的雄性特异区多拷贝基因分布也不同。实时定量PCR(quantitativeReal-timepolymerasechainreaction，qPCR)方法是检测已知基因CNV的有效技术。qPCR所使用试剂成本较低，所用仪器容易普及、操作简单快捷，可实现大样本检测，克服了测序法成本高和探针杂交法信噪比高的缺点。绵羊属牛科动物的一种，目前对绵羊Y染色体连锁基因的研究少之又少，与此同时，由于Y染色体测序困难，造成绵羊Y染色体基因序列极度匮乏。PRAMEY基因是牛科动物Y染色体特有的多拷贝基因。PRAMEY也被发现在绵羊Y染色体上存在。PRAMEY基因分属于PRAME基因家族。PRAME基因家族的成员编码富亮氨酸重复(LRR)蛋白，LRR串联形成的弧形超螺旋空间结构中，保守序列形成一个容易和其他蛋白质结合的疏水性核心，增强蛋白质之间的亲和力和相互作用。在牛中，PRAME基因家族在16号染色体上包含多个拷贝，在17号染色体上包含单个拷贝。在进化过程中，17号染色体拷贝经历了常染色体到Y的转座，从而形成了Y连锁的PRAME基因(PRAMEY)家族，该基因家族向Y染色体的转位表明PRAMEY在精子发生和雄性育性中具有重要作用。但截至目前，尚未发现有关检测羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法及其应用，为PRAMEY基因拷贝数检测提供技术手段，从而发现作为公羊繁殖力早期选育的分子标记，以加快育种进程。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以公羊基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增PRAMEY基因以及作为参照的DDX3Y基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定公羊个体PRAMEY基因的拷贝数；所述的引物对P1为：上游引物F1：5’-TGCCCTCATTTCGTTACCCT-3’下游引物R1：5’-TTTTCGCTTAGTTATCTGCTATCAT-3’所述的引物对P2为：上游引物F2：5’-ATCGTGGGCGGAATGAGTGT-3’下游引物R2：5’-CTTGGTGGAAGCGGTTTTGA-3’。优选的，所述的PRAMEY基因的拷贝数变异区域位于绵羊PRAMEY基因CDS序列的1473位至1758位。优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小约为285bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为136bp。优选的，所述的实时定量PCR所用的扩增体系包括5ng/μL模板DNA1μL，及10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。优选的，所述的实时定量PCR所用的扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸20s，40个循环；72℃延伸5min。上述检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法在绵羊公羊分子标记辅助选择育种中的应用。优选的，所述的PRAMEY基因的拷贝数与PRAMEY基因表达量正相关，PRAMEY基因表达量与公羊繁殖性状正相关(例如，选择PRAMEY基因的拷贝数大于中值拷贝数的湖羊公羊)。优选的，所述的繁殖性状选自睾丸重量和睾丸体积。一种检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的实时定量PCR试剂盒，该试剂盒包括用于分别扩增公羊PRAMEY基因及DDX3Y基因的部分片段的雄性特异性的实时定量PCR引物，即上述引物对P1和P2。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术提供的PRAMEY基因拷贝数变异检测方法，可以利用所设计的引物，并通过实时定量PCR检测个体的PRAMEY基因的拷贝数，根据PRAMEY基因拷贝数变异、PRAMEY基因表达量、公羊重要繁殖性状三者之间的相关关系，结合对于PRAMEY基因在公羊不同组织、不同月龄和不同大小睾丸间的表达特征，可以将PRAMEY基因(包括其拷贝数)作为公羊繁殖性状选择的分子标记，从而加速公羊(例如，湖羊等)繁殖力的选育。本专利技术中基于实时定量PCR的拷贝数变异检测方法具有灵敏度高、成本低，操作简单快捷，便于实验室操作的优点。附图说明图1为PRAMEY基因和DDX3Y基因扩增引物雄性特异性鉴定电泳图；其中：Marker为2000bp电泳DNA梯状标志；泳道1、2为公羊PRAMEY基因的扩增产物(285bp)；泳道3、4为母羊PRAMEY基因的扩增产物；泳道5、6为空白对照(水)；泳道7、8为公羊DDX3Y基因的扩增产物(136bp)；泳道9、10为母羊DDX3Y基因的扩增产物；泳道11、12为空白对照(水)。图2为PRAMEY基因(A)和DDX3Y基因(B)标准曲线；其中：引物效率分别为：2.044(PRAMEY)和2.093(DDX3Y)。图3为PRAMEY基因(A)和DDX3Y基因(B)qPCR溶解曲线。图4为表达特征实验中PRAMEY基因扩增引物雄性特异性鉴定电泳图；其中：Marker为2000bp电泳DNA梯状标志；泳道1、2为公羊PRAMEY基因的扩增产物；泳道本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n以公羊基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增PRAMEY基因以及作为参照的DDX3Y基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定PRAMEY基因的拷贝数；/n所述的引物对P1为：/n上游引物F1：5’-TGCCCTCATTTCGTTACCCT-3’/n下游引物R1：5’-TTTTCGCTTAGTTATCTGCTATCAT-3’/n所述的引物对P2为：/n上游引物F2：5’-ATCGTGGGCGGAATGAGTGT-3’/n下游引物R2：5’-CTTGGTGGAAGCGGTTTTGA-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：
以公羊基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增PRAMEY基因以及作为参照的DDX3Y基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定PRAMEY基因的拷贝数；
所述的引物对P1为：
上游引物F1：5’-TGCCCTCATTTCGTTACCCT-3’
下游引物R1：5’-TTTTCGCTTAGTTATCTGCTATCAT-3’
所述的引物对P2为：
上游引物F2：5’-ATCGTGGGCGGAATGAGTGT-3’
下游引物R2：5’-CTTGGTGGAAGCGGTTTTGA-3’。


2.如权利要求1所述一种检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的PRAMEY基因的拷贝数变异区域位于绵羊PRAMEY基因CDS序列的1473位至1758位。


3.如权利要求1所述一种检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法，其特征在于：基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为285bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为136bp。


4.如权利要求1所述一种检测绵羊PRAMEY基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的实时定量PCR的扩增体系包括5ng/μL模板DNA1μL，及10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对...

【专利技术属性】
技术研发人员：乐祥鹏，徐海月，王丽，李发弟，李万宏，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62