一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR定量检测的引物组合物、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR定量检测的引物组合物、试剂盒及其应用，属于分子生物学检测技术领域，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；本发明专利技术的引物组能够扩增出一条大小为87bp的特异性条带，用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫特异性定量检测，其灵敏度比普通PCR检测高100倍；本发明专利技术中用于拟禾本科根结线虫qPCR定量检测的引物组合物适用于用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR定量检测，具有高灵敏度，对待测样品要求较低等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR定量检测的引物组合物、试剂盒及其应用
本专利技术涉及分子生物学检测
，特别是涉及一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR定量检测的引物组合物、试剂盒及其应用。
技术介绍
植物寄生线虫是水稻生产上的重要病原物，其中危害最为严重的是拟禾本科根结线虫(Meloidogynegraminicola)。该线虫是水稻上重要的内寄生线虫，广泛分布于南亚、东南亚、非洲、美洲和欧洲等国家的水稻产区，引起水稻根结线虫病(RiceRoot-KnotDisease)，通常造成水稻减产11％至80％(Mantelinetal.，2017)，甚至达100％，严重影响水稻产业的稳定发展。近年来，随着国内耕作模式的改变，特别是直播水稻田面积的逐年增加，由拟禾本科根结线虫引起的水稻根结线虫病扩散蔓延迅速，危害越来越严重。2016年至2019年，我国的湖南、湖北、江西、江苏、海南、广西等多地水稻根结线虫病严重发生，引起水稻大面积减产。拟禾本科根结线虫寄主范围广，危害隐蔽，防治极其困难。目前常用的低毒杀线虫剂大多用于旱地作物线虫病害的防治，而能直接用于水田根结线虫病害防控的安全有效、且低成本的防治措施非常有限。特别是作物定植之后再进行水稻根结线虫病害防治尤其困难。所以，开展稻田土壤样品中拟禾本科根结线虫病原快速、定量检测，对水稻根结线虫病的早期预警和实施有效防控措施具有极其重要的意义。目前，拟禾本科根结线虫病原鉴定和检测方法主要包括传统的形态学分离鉴定和以及PCR检测鉴定(Htayetal.,2016)。但是传统的形态学分离鉴定或PCR检测鉴定都需要将线虫从待检测的土壤样品中进行分离和在显微镜下进行初步的形态学观察及挑取线虫等过程，既费时费力，又需要操作人员具备专业的技能和丰富的经验，不能满足快速检测的需要。qPCR检测鉴定技术通过提取土壤中生物总DNA，快速有效检测土壤DNA中拟禾本科根结线虫，并能定量检测土壤中拟禾本科根结线虫的种群密度，为拟禾本科根结线虫的早期预警和制定有效防控措施提供技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR定量检测的引物组合物、试剂盒及其应用，试剂盒用于拟禾本科根结线虫的qPCR定量检测，具有特异性强，灵敏度高、操作简单的特点。对待检样品要求低，可直接应用于土壤中拟禾本科根结线虫的检测。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR检测的引物组合物，所述引物组合物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR检测的试剂盒，包括上述的引物组合物及SYBRPremixExTaq。进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。进一步地，所述阳性对照品包括拟禾本科根结线虫基因组DNA；所述阴性对照品包括灭菌ddH2O。本专利技术还提供一种上述的试剂盒在检测寄主根围土壤中拟禾本科根结线虫中的应用。进一步地，所述应用的应用方法，包括以下步骤：(1)提取待检样品的土壤DNA；(2)以待检样品的土壤DNA为模板，利用所述试剂盒进行qPCR扩增反应，收集荧光数据；(3)分析所述荧光数据的Ct值和琼脂糖凝胶电泳结果来判断是否存在拟禾本科根结线虫；当Ct值>36或显示N/A，且无明显的扩增曲线，则表示待测样品中不含拟禾本科根结线虫；当29.708＜Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，则根据琼脂糖凝胶电泳检测结果条带有无来判断是否存在拟禾本科根结线虫；当Ct值≤29.708，且有明显的扩增曲线，则表示待测样品中含有拟禾本科根结线虫；(4)当Ct值≤29.708时，按照公式(Ⅰ)计算待测样品中拟禾本科根结线虫数量X，所述拟禾本科根结线虫数量X的单位为条(J2)；X＝10(29.708-Ct值)/3.146(Ⅰ)。进一步地，步骤(2)中所述qPCR扩增反应体系为20μL，包括：待测样品基因组DNA1μL，上游引物0.4μL(浓度10μM)，下游引物0.4μL(浓度10μM)，SYBRPremixExTaq10μL，灭菌ddH2O8.2μL。进一步地，步骤(2)中所述qPCR扩增反应的程序为：95℃30s，[95℃5s、64℃30s，39个循环]，72℃30s，反应结束。本专利技术公开了以下技术效果：(1)本专利技术提供了一种用于qPCR检测土壤中拟禾本科根结线虫的引物组合物，该引物组合物是根据拟禾本科根结线虫SCAR序列测定结果设计筛选出引物，特异性强，只对含有拟禾本科根结线虫土壤样品检测结果才有荧光信号。(2)本专利技术提供了一种用于检测土壤中拟禾本科根结线虫的试剂盒，其灵敏度高，在0.5g土壤中对拟禾本科根结线虫的检测灵敏度可达到0.01条J2幼虫，比常规普通PCR检测灵敏度高100倍。(3)本专利技术提供了一种试剂盒在检测拟禾本科根结线虫中的应用，土壤样品总DNA提取简便快速，不需要对待检测的土壤或根样进行线虫分离、显微镜下形态鉴定及挑虫等操作过程，直接提取土壤或根样总DNA进行快速检测，从提取土壤总DNA到获得检测结果仅需要3h左右，耗时短、操作简单。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为引物的qPCR检测以及溶解曲线，其中，1为以拟禾本科根结线虫，2为去离子水为模板扩增；图2为引物的特异性检测，其中，1为拟禾本科根结线虫，2-7分别南方根结线虫、象耳豆根结线虫、旱稻孢囊线虫、柑橘半穿刺线虫、矮化属线虫和咖啡短体线虫，8为去离子水对照；图3为优化的qPCR体系灵敏度检测，其中，A为qPCR检测，B为普通PCR检测；泳道1-8为0.5g分别含有10、5、1、10-1、10-2、10-3、10-4和0条拟禾本科根结线虫二龄幼虫；图4为土壤中拟禾本科根结线虫数量与Ct值的关系的定量检测标准曲线；图5为土壤样品中J2数量与Ct值间的相关性曲线，其中，“×”表示田间土壤样品的Ct值。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR检测的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括上游引物和下游引物；/n所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；/n所述下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR检测的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合物及SYBRPremixExTaq。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括拟禾本科根结线虫基因组DNA；所述阴性对照品包括灭菌ddH2O。


5.一种权利要求2-3任一项所述的试剂盒在检测寄主根围土壤中拟禾本科根结线虫中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用方法，包括以下步骤：
(1)提取待检样品的土壤DNA；
(2)以待检样品的土壤DNA为模板，利用所述试剂盒进行qPCR扩增反应，收集荧光数据；
(3)分析所述荧光数据...

【专利技术属性】
技术研发人员：成飞雪，王东伟，刘勇，张德咏，王剑，何清聪，唐蓓，
申请(专利权)人：湖南省植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43