瘦肉型定远猪品系眼肌面积及肉质相关SNP分子标记制造技术

本发明专利技术公开了一种瘦肉型定远猪品系眼肌面积及肉质相关SNP分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，上述序列中第170位碱基处为碱基突变位点，该碱基突变位点为G或A。本发明专利技术公开了一种瘦肉型定远猪品系眼肌面积及肉质相关SNP分子标记方法，包括如下步骤：提取猪中包含上述分子标记的基因组DNA；采用上述上下游引物、基因组DNA和PCR反应缓冲液进行聚合酶链式反应，得到体外扩增产物；对体外扩增产物采用限制性内切酶进行酶切反应，得到酶切产物；对酶切产物进行多态性检测，获得各个个体的基因型。本发明专利技术公开了上述分子标记和/或上述上下游引物在瘦肉型定远猪品系生猪育种中的应用。

【技术实现步骤摘要】
瘦肉型定远猪品系眼肌面积及肉质相关SNP分子标记
本专利技术涉及生猪辅助育种
，尤其涉及一种瘦肉型定远猪品系眼肌面积及肉质相关SNP分子标记及其方法、应用。
技术介绍
瘦肉型定远猪品系是由巴克夏作父本、定远猪作母本进行杂交后，再横交固定，选育得到的新品系，该瘦肉型定远猪品系含巴克夏和定远猪血统均为50％，被毛全黑，体型大小处于巴克夏和定远猪两者之间。未经选育的群体内眼肌面积、肌内脂肪含量、肉色等指标变异系数较大(>20％)，因此要经过5个世代甚至更多代次的选育才能将眼肌面积、肌内脂肪、肉色等性状进行固定并稳定遗传。但传统的选育过程中无法对种猪的眼肌面积、肌内脂肪、肉色进行选育，因为这些性状无法在活体中测定，必须将猪屠宰后对肉质进行分析后得到，而屠宰后的猪无法作为种猪用于繁殖下一代，因此必须找到用于种猪选育的标记方法，辅助进行选择。常规选育中背膘厚与肌内脂肪呈反向相关，即通过选育背膘厚度变薄的猪，其肌内脂肪含量也变低，因此通过传统的背膘厚选择，势必肌内脂肪含量随之变低，而肌内脂肪含量是评价猪肉风味、口感、嫩度的重要指标，是关乎猪肉品质的最重要指标。肉色也是关乎猪肉品质的重要指标，肉色是消费者购买时的第一印象，因此肉色的好坏直接影响猪肉的价格。生猪育种过程中期望得到眼肌面积大、肌内脂肪含量高、肉色好的猪种，通过传统的育种方法无法得到两者兼顾的品种，因此寻求相关分子标记方法是较为有效的辅助选择方法。在育种上间接性状的选择需要根据与之相关的性状或标记进行选择，同样可以取得育种目标，因此也要通过相关标记进行选育。NR5A2(nuclearreceptorsubfamily5，groupA，member2，孤核受体5A亚家族成员2基因)是一种重要的孤儿受体，是一种有配体激活的转录因子，属于核受体的NR5A亚家族，与体细胞重编程、胚胎发育、类固醇激素生成和癌症发生等有密切关系。在成年哺乳动物中，NR5A2主要在肝、肠和卵巢等组织中表达。NR5A2能够激活肝脏中蛋白基因的转录以及多种肝细胞转录因子，如肝细胞核因子hnf3β、hnf1α和hnf4α基因的转录。经过大量的试验，人们发现，NR5A2参与胚胎的早期发育，在胚胎干细胞中大量表达，它可以调节胚胎的内胚层的细胞的增殖，在胚胎发育中起重要作用。NR5A2可以调节干细胞多能性调节因子的表达从而调节胚胎的发育。此外，NR5A2在胚胎发育的7-8d于卵黄囊内胚层、鳃弓、神经嵴细胞大量表达。随着胚胎的发育，器官的分化，NR5A2在肝、肠、胰腺中表达，伴随胚胎的继续发育，NR5A2在肝、肠、胰腺中的表达逐渐稳定。通过各种研究，人们还发现NR5A2可以对肺肝组织的蛋白和酶进行调控。通过与低繁殖力猪种巴克夏猪NR5A2基因编码区序列的比对分析，发现了5个突变位点，其中2个碱基突变G524A和A1276G引起氨基酸的改变(分别为S175N和N426D)，而另外3个核苷酸突变为同义突变，这些突变位点的发现将为在分子水平上揭示二花脸猪高繁殖力性状形成的机制提供基础。但NR5A2在瘦肉型定远猪品系中未发现有报道，在GenBank和Ensembl数据库中也均未发现有报道。
技术实现思路
为了实现孤核受体5A亚家族成员2基因(NR5A2)基因(ENSSSCG00000024975)g.22725660G>A突变体检测，选育眼肌面积大、肌内脂肪含量高、肉色好的猪群，本专利技术提供一种瘦肉型定远猪品系眼肌面积及肉质相关SNP分子标记及其方法、应用。一种瘦肉型定远猪品系眼肌面积及肉质相关SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，位于猪chr10:22725491至chr10:22725912处(或NR5A2基因)，上述序列中第170位碱基处(或猪chr10:22725660bp处)为碱基突变位点，该碱基突变位点为G或A。一种检测上述分子标记的上下游引物，其核苷酸序列如下所示：上游引物：5’-TCTACTGTTAGGAAGACCCATC-3’，下游引物：5’-TGCTGCCTGAAAATCATCCT-3’。一种瘦肉型定远猪品系眼肌面积及肉质相关SNP分子标记方法，包括如下步骤：(1)提取猪中包含上述分子标记的基因组DNA；(2)采用上述上下游引物、步骤(1)所得基因组DNA和PCR反应缓冲液进行聚合酶链式反应，得到体外扩增产物；(3)对步骤(2)所得体外扩增产物采用限制性内切酶进行酶切反应，得到酶切产物；(4)对步骤(3)所得酶切产物进行多态性检测，获得各个个体的基因型。优选地，步骤(2)中，聚合酶链式反应体系包括：10μLPCR反应缓冲液、0.5μL10mmol/mL上游引物、0.5μL10mmol/mL下游引物、1μL浓度100ng/μL的DNA基因组模板溶液、8μL纯水，其终体积为20μL。优选地，步骤(2)中聚合酶链式反应的操作具体如下：将20μL聚合酶链式反应体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条件如下：①95℃预变性4min，②95℃变性30s，③55℃退火30s，④72℃延伸30s，⑤重复第②～④步骤35个循环，⑥72℃延伸5min，最后降温至10℃保存，得到体外扩增产物。优选地，步骤(3)中，酶切反应的具体操作如下：向5μL步骤(2)所得体外扩增产物中加入0.5μL10U/μLMsII限制性内切酶和1μLMsII限制性内切酶缓冲液，再加入3.5μL水混匀，37℃反应2h，得到10μL酶切产物。优选地，步骤(4)中，多态性(RLFP)检测操作如下：将5μL步骤(3)所得酶切产物采用质量分数为1.5％琼脂糖凝胶电泳1h，电泳条件如下：常温、电压120V；得到含酶切产物的凝胶，将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因型。优选地，步骤(4)中各基因型如下：GG型个体为不能切开，包括422bp一条片段；GA型个体既含有不能切开，也含有可切开的片段，包括174bp、248bp和422bp三条片段；AA型个体为完全切开，包括174bp和248bp两条片段。上述分子标记在瘦肉型定远猪品系生猪育种中的应用。上述上下游引物在瘦肉型定远猪品系生猪育种中的应用。本申请人在研究定远猪全基因组测序结果中，发现NR5A2基因(ENSSSCG00000024975)5’上游区域-2242bp处存在一个突变位点由G突变为A，该位点位于猪第10号染色体的22725660bp处(猪基因组版本11.1)，为本申请人新发现的SNP位点。本申请人首次发现NR5A2基因的chr10:22725660位点存在多态性(G突变为A)，并与猪眼肌面积、肌内脂肪含量、肉色存在着极显著相关。因此本申请人分析了瘦肉型定远猪品系的NR5A2基因的突变位点，发现猪NR5A2基因的chr10:22725660处存在的突变位点(G突变为A)导致了一个限制性内切酶MsII的酶切多态性位点。本申请人在146头本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种瘦肉型定远猪品系眼肌面积及肉质相关SNP分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，上述序列中第170位碱基处为碱基突变位点，该碱基突变位点为G或A。/n

【技术特征摘要】
1.一种瘦肉型定远猪品系眼肌面积及肉质相关SNP分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，上述序列中第170位碱基处为碱基突变位点，该碱基突变位点为G或A。


2.一种检测如权利要求1所述分子标记的上下游引物，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：
上游引物：5’-TCTACTGTTAGGAAGACCCATC-3’，
下游引物：5’-TGCTGCCTGAAAATCATCCT-3’。


3.一种瘦肉型定远猪品系眼肌面积及肉质相关SNP分子标记方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取猪中包含如权利要求1所述分子标记的基因组DNA；
(2)采用如权利要求2所述上下游引物、步骤(1)所得基因组DNA和PCR反应缓冲液进行聚合酶链式反应，得到体外扩增产物；
(3)对步骤(2)所得体外扩增产物采用限制性内切酶进行酶切反应，得到酶切产物；
(4)对步骤(3)所得酶切产物进行多态性检测，获得各个个体的基因型。


4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)中，聚合酶链式反应体系包括：10μLPCR反应缓冲液、0.5μL10mmol/mL上游引物、0.5μL10mmol/mL下游引物、1μL浓度100ng/μL的DNA基因组模板溶液、8μL纯水，其终体积为20μL。


5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)中聚合酶链式反应的操作具体如下：将20μL聚合酶链式反应体系...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学道，李庆岗，胡剑，陈鹏，
申请(专利权)人：定远县安康农牧有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34