一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法，所述引物组的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术的引物组和试剂盒的灵敏性高，对单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到5.37×10

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及分子生物学快速检测
，特别的涉及一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
单核细胞增生李斯特菌属于李斯特菌属，单核细胞增生李斯特菌是属中唯一可使人类致病的致病菌，广泛存在于自然界中，如土壤、地面水、冰箱内、牛奶及奶制品、水产品和肉制品中。该菌经口摄入后，首先侵入肠道的上皮细胞，在细胞内和细胞间扩散，然后经入血液感染其它敏感的机体细胞，可引起人脑膜炎、败血症和流产，尤其对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重。人类感染单增李斯特菌后有高达20%〜30%的致死率。1986年，世界卫生组织(WHO)将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一；2000年，WHO又将其列为需要重点监测的食源性致病菌之一。因此，加强食品中李斯特菌监测，应对李斯特菌导致的食品安全突发事件，已成为各国政府和国际相关组织所面临的迫切任务。目前我国现行的李斯特菌检测国家标准方法主要是GB4789系列标准，标准中的检测主要依靠传统的细菌培养、血清学、生化鉴定等方法，包括富集、选择性培养、生化鉴定。这些传统检测方法具有劳动强度高、费用高、检测周期长，一般需要4-7天，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低，且一次性完成大批量的样本检测，较为耗时耗力，通量较低，已不能满足我国公共卫生突发事件应急检测的需要。更重要的是，传统方法检测灵敏度较低、特异性不足，尤其对于来源相近的菌株，传统方法很难加以区分。由于PCR方法从分子水平上检测单增李斯特菌，具有较高的特异性和灵敏度，特别是实时荧光定量PCR法、恒温核酸扩增方法等，可以实时监测体系的反应过程，因此在李斯特菌的检测上得到了广泛的应用。如BessesenMT等于1990年建立了PCR检测单核细胞增生李斯特菌的方法，通过扩增李斯特氏菌的特异基因溶血素基因hlyA中以达到快速检测单核细胞增生李斯特菌的效果（ApplEnvironMierobiol,1990,56(9):2930-2932）。专利技术专利201911188273.2公开了用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物、RPA试剂盒及其应用，特点是RPA引物是基于单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因设计的。综上所述，借助分子生物学的方法实现单增李斯特的快速检测，技术已相对成熟，但基于不断增长的微生物基因组、转录组等大量数据的更新完善，导致基于上述靶基因序列获得的引物在实际应用中很难确保其特异性：hlyA基因总长1590bp，在单增李斯特与伊氏李斯特菌中只存在43bp的差异，序列一致性高达97%，与英诺克李斯特菌中hly的序列一致性也高达94%，若想通过该基因区分两种菌株，则可选择的用于PCR引物设计的区域较少，考虑到引物GC含量，退火温度等因素后，可选区域会进一步缩小，不利于引物的设计及后期的实验。荧光定量PCR、RPA和LAMP与常规PCR相比，各有优缺点，荧光定量PCR可以实现实时的定量检测，但试剂及仪器成本较高，对实验人员的实验技术要求较高；RPA和LAMP虽对仪器要求较低，但引物设计较为困难，往往需要设计几对GC含量合适，打分较高的优质引物组，在序列条件不是特别好的情况下，较难实现；常规PCR具有成本低，引物质量要求相对较低的优势，在日常的科研实验和检验任务中占据主导地位，因此，挖掘新的特异基因以及其引物对组，建立一种简便、快速、灵敏、特异、准确的单核细胞增生李斯特菌检测方法具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的上述不足，本专利技术的目的在于：为单核细胞增生李斯特氏菌的特异性检测提供一个新的靶标基因、引物组、试剂盒和方法，所述引物组具有较高的种间特异性，所述方法具有检测时间短、特异性好和灵敏度高的特点。为了解决上述技术问题，本专利技术采用了如下的技术方案：一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组，所述引物组是基于单核细胞增生李斯特菌的IAP基因设计的，IAP基因的核酸序列如SEQIDNo.1所示，引物组的核酸序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，分别为：IAP-F:5’-ACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAG-3’，IAP-R:5’-CCAGAGCCGTGGATGTTATCGTATT-3’。本专利技术还提供了用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组，还包括用于DNA扩增所需要的所有试剂；包括脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、Tag酶、缓冲液、稀释剂、镁离子或辅助因子。本专利技术还提供了一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，实验步骤如下：1）提取待检样品的基因组DNA；2）以提取的DNA为模板，用所述的试剂盒进行PCR扩增；3）结果判定：对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，判断样品中是否有单核细胞增生李斯特氏菌。作为优选的，步骤(2)中所述的PCR扩增体系为：10×PCRbuffer2.5μL，10μmol/L的引物各0.5μL，10mmol/L的dNTP0.5μL，5U/μL的Taq酶0.5μL，DNA模板1.0μL，25mmol/L的Mg2+1.5μL，ddH2O18μL。作为优选的，步骤(2)中所述的PCR扩增程序为：95℃预变性5min，进入循环:95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min，共35个循环，然后72℃延伸10min。作为优选的，若PCR扩增产物在539bp处有特异性的电泳条带，则样品中存在单核细胞增生李斯特氏菌。相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术经过前期充分的生物信息学分析，对候选靶标基因和候选引物进行了大量的筛选和优化，最终特异性强，灵敏度高且使用范围广的引物组，在后期的实验验证中，该引物组对单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到5.37×10-7ng/μL，并且引物组与其它李斯特菌属菌及其它常见致病菌之间均无特异性扩增条带，判读结果为阴性，表明该引物对不仅检测灵敏度较高，还具有良好的种间特异性，为单核细胞增生李斯特氏菌的特异性检测提供了一个新的靶标基因及其引物组，同时也为单核细胞增生李斯特菌的现场快速检测提供了有效的技术手段。2本专利技术的检测方法中PCR扩增条件简单，操作简单，成本较低，采用简单PCR反应后，通过电泳检测便可快速鉴定单核细胞增生李斯特菌，具有高效、便捷及成本低廉等显著优点，对食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测具有指导意义。附图说明图1为本专利技术对单核细胞增生李斯特氏菌的特异性检测结果图，泳道1为DNA分子量marker，泳道2~10依次为：单核细胞增生李斯特菌ATCC19115，斯氏李斯特菌ATCC35967，伊氏李斯特菌ATCC19119，马红球菌ATCC6939，英诺克李斯特菌CICC10417，威氏李斯特菌CICC21672，格氏李斯特菌CICC21670，大肠埃希氏菌O157：H7CICC21530，阴性对照。图2为本专利技术对单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏性检测结果图，泳道1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组，其特征在于，所述引物组的核酸序列为：IAP-F:5’-ACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAG-3’，IAP-R:5’-CCAGAGCCGTGGATGTTATCGTATT-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组，其特征在于，所述引物组的核酸序列为：IAP-F:5’-ACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAG-3’，IAP-R:5’-CCAGAGCCGTGGATGTTATCGTATT-3’。


2.一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。


3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，还包括用于DNA扩增所需要的添加剂；所述添加剂包括脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、缓冲液、稀释剂、镁离子或辅助因子。


4.一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待检样品的DNA；
2）以提取的DNA为模板，以权利要求1所述的引物组进行PCR扩增，得到扩增产物；
3）结果判定：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，判断样品中是否...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明娟，秦爱，李根容，肖昭竞，龙梅，王娟，袁磊，余秋地，
申请(专利权)人：重庆市计量质量检测研究院，
类型：发明
国别省市：重庆;50