一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合与检测方法技术

本发明专利技术提供一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合与检测方法。通过两种病原物共有特异性片段设计6条引物，可用于兰科植物检测胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（

【技术实现步骤摘要】
一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合与检测方法
本专利技术涉及植物病毒检测领域，具体涉及一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合与检测方法。
技术介绍
软腐病（softrot）是多种栽培作物的重要病害，兰科植物极易受软腐病的影响，胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（Erwiniacarotovorasubsp.carotovora）与达旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)为导致兰花软腐病的主要病原物，曾在文心兰(Oncidium)、石斛兰(Dendrobium)、蝴蝶兰（Phaleanopsis）等多种软腐病发病植株上被发现。二者具有较近的亲缘关系，并都依赖于分泌的果胶酶、聚半乳糖醛酸酶等胞外酶降解寄主植物细胞壁产生致病性，具传播性强、破坏力大，高温多雨季节可导致兰科植物大面积发病，造成植株大量死亡。由于目前规模化种植的文心兰、石斛兰、蝴蝶兰还未发现对软腐病具有抗性的种质。因此，从种源与环境切断软腐病病原物的传播途径是预防兰科植物软腐病重要手段。传统清除软腐病病原需通过清除已有症状发病植株来进行。此方法除需要较强的技术经验，还强烈受到环境条件影响，如上述病原物在低温环境不发病，但可在植株内部、土壤与水中潜伏数月且不引起任何症状。因此，利用软腐病病原内在特征物进行检测是发现潜在的软腐病病原的有效技术手段。本专利技术利用从兰科中分离的不同类型胡萝卜欧文氏菌胡萝卜亚种与狄克氏菌共有序列的特征片段设计引物，可在同时检测胡萝卜欧文氏菌胡萝卜亚种与狄克氏菌，并可利用3个特异位点设计引物，产生两个目的片段以避免假阳性的产生。同时为避免假阴性的产生，本专利技术还设计1对适用于文心兰、石斛兰、蝴蝶兰的共有基因序列内参引物，可排除由于DNA提取质量及检测程序排除假阴性。
技术实现思路
针对本领域存在的不足，本专利技术提供一种检测兰科植物2种软腐病病原物引物组合与检测方法，可同时检测胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种与达旦提狄克氏菌病原物。本专利技术采用如下技术方案：检测兰科植物2种软腐病病原物引物组合，通过针对两个病原物三个共有特征位点设计6条引物，真阳性样品可产生两个阳性片段，具体引物序列如下：达旦提狄克氏菌:上游引物：DickeyaF85：AAGCTTGCTTCCCCGCCG，下游引物：DickeyaR260:CCTACTAGCTAATCCCATCTGGGTT，DickeyaR418:GAAACCCTGATGCAGCCATG，胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种引物：上游引物：PCCF85：GAAGAGCTTGCTCTTTGGGTGAC，下游引物：PccR260:CTACTAGCTAATCCCATCTGGGCA，PCCR418:GCAAGCCTGATGCAGCCAT。同一病原物的3条引物可共同反应，如达旦提狄克氏菌DickeyaF85可与DickeyaR260、DickeyaR418共同反应，胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种则为PCCF85可与PCCR260、PCCR418共同反应；或者上游引物可分别与两条下游引物在不同PCR管内反应，如达旦提狄克氏菌引物DickeyaF85与DickeyaR260，DickeyaF85与DickeyaR418分别反应，胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种则为引物PCCF85与PCCR260，PCCF85与PCCR418分别反应。通过针对文心兰、石斛兰、蝴蝶兰两个共有特征位点设计位点，还设计2条内参引物：ORCH_ACTF850：GTGTGGCTAACACCATCACCAG，ORCH_ACTR1170：CTGGTTTTGCTGGTGATGATGC。一种检测兰科植物2种软腐病病原物的方法，包括如下步骤：（1）待测样品总DNA提取；（2）采用所述引物组合，以待测样品DNA为模板，以进行PCR反应，获得扩增产物；（3）1%琼脂糖电泳检测1-6μL扩增产物，若添加病原物引物PCR产物出现200bp以及335bp大小阳性条带，则表示样品含有胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种与达旦提达旦提狄克氏菌病原物；若阴性且仅出现兰科内参引物条带，则表示样品DNA可用，但未检测到上述两种病原物。所述PCR反应体系为20μL：DNA模板1μL，10μmol/L不同病原或内参上、下游引物各1μL，2×TaqPCRMix反应液10μL，加ddH2O至总体积20μL。所述PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性20s，52-56℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸6min。本专利技术的优点在于：本专利技术通过针对两个病原物三个共有特征位点设计6条引物，真阳性样品可产生两个阳性片段，用于排除假阳性；本专利技术还增加排除假阴性的内参引物设计，通过针对文心兰、石斛兰、蝴蝶兰两个共有特征位点设计位点，真阴性可产生1个阳性片段；本专利技术设备要求低，全过程最快仅需要2小时可完成；本专利技术检测方法可检出兰科病叶灵敏度相当于10-5g病叶组织量（50ng病叶），即在样品DNA稀释10000倍后仍能扩增出病原物特异性条带。附图说明图1接种病原菌的叶片，其中A为接种胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种24h蝴蝶兰叶片；B为接种达旦提狄克氏菌24h文心兰叶片；C为健康石斛兰叶片。图2不同引物在接种与不接种兰科叶片PCR扩增效果。泳道1：内参引物在蝴蝶兰叶片DNA扩增效果；泳道2：内参引物文心兰叶片DNA扩增效果；泳道3：3条胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种引物在接种胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种24h蝴蝶兰叶片DNA扩增效果；泳道4：3条达旦提狄克氏菌引物在接种达旦提狄克氏菌24h文心兰叶片DNA扩增效果；泳道5：内参引物在石斛兰扩增效果，泳道6，7：病原菌引物在健康石斛兰扩增效果。图33条达旦提狄克氏菌特异性引物在接种达旦提狄克氏菌24h文心兰DNA扩增效果。泳道1-6为达旦提狄克氏菌侵染文心兰DNA从1、10、100、1000、10000、100000倍稀释液的扩增效果，M为DNAMarker2000。图4同时接种达旦提狄克氏菌与胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种蝴蝶兰24h叶片。图5不同引物在蝴蝶兰叶片同时接种达旦提狄克氏菌与胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种扩增效果。泳道1为达旦提狄克氏菌引物DickeyaF85与DickeyaR480扩增效果，泳道2达旦提狄克氏菌引物DickeyaF85与DickeyaR260扩增效果,泳道3内参引物扩增效果，泳道4为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种引物PCCF85与PCCR480扩增效果，泳道5胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种引物PCCF85与PCCR260扩增效果,泳道6内参引物扩增效果。具体实施方式以下通过具体实验对本专利技术进行解释，需要解释的是，下述实施例仅作为解释和说明，不构成对本专利技术的任何限制。实施例1：如图1所示，以三明市农业科学本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合，其特征在于：包括6条引物，真阳性样品会产生两个阳性片段，引物具体序列如下：/n达旦提狄克氏菌引物：/nDickeya F85：AAGCTTGCTTCCCCGCCG，/nDickeya R260: CCTACTAGCTAATCCCATCTGGGTT，/nDickeya R418: GAAACCCTGATGCAGCCATG；/n胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种引物：/nPCC F85：GAAGAGCTTGCTCTTTGGGTGAC，/nPcc R260: CTACTAGCTAATCCCATCTGGGCA，/nPCC R418: GCAAGCCTGATGCAGCCAT。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合，其特征在于：包括6条引物，真阳性样品会产生两个阳性片段，引物具体序列如下：
达旦提狄克氏菌引物：
DickeyaF85：AAGCTTGCTTCCCCGCCG，
DickeyaR260:CCTACTAGCTAATCCCATCTGGGTT，
DickeyaR418:GAAACCCTGATGCAGCCATG；
胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种引物：
PCCF85：GAAGAGCTTGCTCTTTGGGTGAC，
PccR260:CTACTAGCTAATCCCATCTGGGCA，
PCCR418:GCAAGCCTGATGCAGCCAT。


2.根据权利要求1所述的一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合，其特征在于，还包括2条内参引物：
ORCH_ACTF850：GTGTGGCTAACACCATCACCAG，
ORCH_ACTR1170：CTGGTTTTGCTGGTGATGATGC。


3.根据权利要求1所述的一种检测兰植物2种软腐病病原物的引物组合，其特征在于，所述病原物为胡萝卜软腐欧文氏菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑世仲，叶炜，王培育，江胜滔，陈美霞，
申请(专利权)人：宁德师范学院，
类型：发明
国别省市：福建;35