在种水平上鉴定样本中双歧杆菌的方法及其专用引物技术

本发明专利技术公开了一种在种水平上鉴定样本中双歧杆菌的方法及其专用引物。本发明专利技术保护一种特异引物对，由序列1所示引物F1和序列2所示引物R1组成。本发明专利技术还保护一种特异引物组，由引物对甲和引物对乙组成；引物对甲由序列8所示引物F2和序列9所示引物R2组成；引物对乙由序列10所示引物F3和序列11所示引物R3组成。本发明专利技术还保护所述特异引物对或所述特异引物组的应用，为在种水平上鉴定样本中双歧杆菌。本发明专利技术为市场上相关乳制品的监管提供了新的思路，也为鉴定肠道样本或其他样本中具体的双歧杆菌提供了新的方法。

【技术实现步骤摘要】
在种水平上鉴定样本中双歧杆菌的方法及其专用引物
本专利技术属于生物
，具体涉及一种在种水平上鉴定样本中双歧杆菌的方法及其专用引物。
技术介绍
如今，全球食品市场上功能性乳制品层出不穷，人们对于新型益生菌乳制品的需求日益增长。双歧杆菌因其对人体健康具有生物屏障作用、营养作用、抗肿瘤作用、免疫调节作用、改善胃肠道功能和抗衰老等多种重要的生理功能，成为目前国内外研究极为热门的代表性益生菌。自1899年法国巴黎巴斯德研究所首次从母乳喂养的婴儿肠道菌群中分离出双歧杆菌，目前已发现双歧杆菌共57种(亚种)。然而，随着乳制品的大规模生产，用类似双歧杆菌代替获批双歧杆菌或乳制品中双歧杆菌添加比例与标识不符等乱象层出不穷。因此，为了维护消费者的合法权益，快速、准确地鉴定双歧杆菌至关重要。同时，这也对识别复杂肠道菌群中双歧杆菌的种类及丰度具有重要意义。传统的双歧杆菌鉴定方法是基于伯杰氏手册中细菌的表型特征，但对于一些表型特征相似，理化性质一致的种很难区分。随着分子生物学的发展，细菌的16SrDNA基因的全长序列已经成为菌种鉴定的金标准，但是由于片段过长(约1.5Kb)不能进行二代高通量测序。如果要用16S全长鉴定环境中的双歧杆菌，就需要将环境中全部细菌的16SrDNA的全长PCR产物克隆到质粒载体上再测序，该方法需要耗费大量的人力、物力。若双歧杆菌在环境中的丰度很低，利用该方法检测到双歧杆菌的概率会呈指数倍降低。而且16S高变区(如V3区、V3V4区等)虽然适用于二代高通量测序，但序列比较保守，片段过短，结果只能在属水平上区分菌种，对于亲缘性较近的菌种分辨率不高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种在种水平上鉴定样本中双歧杆菌的方法及其专用引物。本专利技术保护一种特异引物对，由引物F1和引物R1组成；引物F1如序列表的序列1所示；引物R1如序列表的序列2所示。引物F1和引物R1的具体摩尔比例为1:1。本专利技术还保护一种特异引物组，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由引物F2和引物R2组成，引物F2如序列表的序列8所示，引物R2如序列表的序列9所示；所述引物对乙由引物F3和引物R3组成，引物F3如序列表的序列10所示，引物R3如序列表的序列11所示。引物F2和引物R2的具体摩尔比例为1:1。本专利技术还保护所述特异引物对或所述特异引物组的应用，为在种水平上鉴定样本中双歧杆菌。本专利技术还保护所述特异引物对或所述特异引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌。本专利技术还保护一种PCR制剂，含有所述特异引物对或所述特异引物组。本专利技术还保护一种试剂盒，包括所述特异引物对或所述特异引物组或所述PCR制剂。本专利技术还保护所述PCR制剂或所述试剂盒的应用，为在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌。本专利技术还保护一种在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌的方法，依次包括如下步骤：(1)提取样本的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增；(3)回收PCR扩增产物并测序；(4)将测序结果在数据库中进行BLAST比对，根据数据库中的最相似菌株判断样本中是否含有双歧杆菌以及含有哪种双歧杆菌。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，引物F1和引物R1的具体摩尔比例为1:1。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，引物F1和引物R1的浓度均为10μM。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，模板DNA的含量为50-100ng。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的退火温度具体可为54℃。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。所述最相似菌株即数据库中与某一测序结果序列同一性最高且同一性为90％以上序列所属的菌。所述数据库具体可为NCBI。本专利技术还保护一种在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌的方法，依次包括如下步骤：(1)提取样本的基因组DNA；(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用所述引物对甲进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；(3)以步骤(2)得到的PCR扩增产物为模板，采用所述引物对乙进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；(4)将多个样本步骤(3)得到的PCR扩增产物混合后进行高通量测序，获得各个样本的测序结果，将各个样本的测序结果在数据库中进行BLAST比对，根据数据库中的最相似菌株判断样本中是否含有双歧杆菌以及含有哪种双歧杆菌。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，引物F2和引物R2的具体摩尔比例为1:1。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，引物F2和引物R2的浓度均为10μM。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应体系中，模板DNA的含量为50-100ng。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的退火温度具体可为54℃。所述方法的步骤(2)的PCR扩增的反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。高通量测序具体采用IlluminaHiSeq2500测序平台。所述最相似菌株即数据库中与某一测序结果序列同一性最高且同一性为90％以上序列所属的菌。所述数据库具体可为NCBI。以上任一所述样本为生物样本、生物代谢物、生物加工品。以上任一所述样本为粪便样本、奶制品。所述奶制品可为酸奶。以上任一所述双歧杆菌为双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)、青春双歧杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongumsubsp.Infantis)或长双歧杆菌长亚种(Bifidobacteriumlongumsubsp.Longum)。本专利技术提供了一种快速、准确地在种水平上鉴定环境样本中双歧杆菌的方法。通过本专利技术提供的方法，可以对目前市面上的乳制品、人肠道中益生菌的种类进行鉴定，快速准确、应用范围广且限制少。一方面本专利技术能够有效地监管乳制品市场的乱象，使消费者买到真正有效的产品。另一方面本专利技术通过对人肠道双歧杆菌种类的鉴定，能够及时补充所需要的益生菌。本专利技术为市场上相关乳制品的监管提供了新的思路，也为鉴定肠道样本或其他样本中具体的双歧杆菌提供了新的方法。附图说明图1为实施例2的电泳图。图2为实施例3的电泳图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、特异引物对的获得一、双歧杆菌菌种鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异引物对，由引物F1和引物R1组成；引物F1如序列表的序列1所示；引物R1如序列表的序列2所示。/n

【技术特征摘要】
1.特异引物对，由引物F1和引物R1组成；引物F1如序列表的序列1所示；引物R1如序列表的序列2所示。


2.特异引物组，由引物对甲和引物对乙组成；
所述引物对甲由引物F2和引物R2组成；引物F2如序列表的序列8所示；引物R2如序列表的序列9所示；
所述引物对乙由引物F3和引物R3组成；引物F3如序列表的序列10所示；引物R3如序列表的序列11所示。


3.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述特异引物组的应用，为在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌。


4.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述特异引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为在种水平上鉴定样本中的双歧杆菌。


5.一种PCR制剂，含有权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述特异引物组。


6.一种试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述特异引物组或权利要求4所述PCR制剂。


7.权利要求5所述PCR制剂或权利要求6所述试剂盒的应用，为在种水平上鉴...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱宝利，律娜，张瑞芬，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11