一种同时检测三种鱼源链球菌的试剂盒和检测方法技术

同时检测三种链球菌的引物组合，组成为：SEQ ID MO:1、2的检测无乳链球菌的上下游引物，SEQ ID MO:3、4的检测停乳链球菌链球菌的上下游引物，SEQ ID MO:5、6的检测海豚链球菌的上下游引物。一种试剂盒，由DNA提取试剂和PCR反应试剂组成，DNA提取试剂由TE缓冲液、蛋白酶K、氯仿、异丙醇、乙醇、双蒸水组成；PC反应试剂含有反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、所述6种引物、去离子水。同时检测所述三种链球菌的方法，用所述提取试剂提取样品中的DNA，用所述反应试剂对所述DNA作PCR扩增，所述扩增产物作凝胶电泳。本发明专利技术能同时检测所述三种链球菌，检测简便、快速、灵敏度高、特异性强，适用于水生动物大规模分子流行病学调查分析及水产品的质量安全检测需求。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测三种鱼源链球菌的试剂盒和检测方法
本专利技术属于生物
，涉及靶DNA片断的检测技术，具体涉及一种同时检测无乳链球菌、海豚链球菌及停乳链球菌的快速检测试剂盒及检测方法。技术背景鱼类链球菌病是由链球菌属细菌感染引起的传染病，致病菌种类主要包括海豚链球菌(Streptococcusiniae)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)和停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)。链球菌感染宿主范围广、致死率高、发病持续时间长，给水产养殖业造成了巨大经济损失。无乳链球菌是罗非鱼最主要的致病菌之一，该菌也可引起多种水产动物如虹鳟、斑点叉尾鮰、牙鲆、大菱鲆、真鲷和齐口裂腹鱼等的败血症和脑膜炎。海豚链球菌最初分离自患病的淡水海豚，其后发现该菌可感染罗非鱼、虹鳟、大菱鲆、红拟石首鱼、牙鲆、斑点叉尾鮰和鲑鱼等几十种淡海水鱼类，引起养殖鱼类流行性脑膜炎，是水生动物暴发性疾病的重要原菌之一。停乳链球菌引起鱼类疾病的报道出现较晚，2004年日本的Nomoto等首次报道了停乳链球菌感染导致杜氏鰤和五条鰤死亡。近年来的研究表明，停乳链球菌感染的种类及流行范围正在逐渐扩张，中国台湾的梭鱼、布氏鲳鲹、鲻鱼、军曹鱼，马来西亚的白星笛鲷、布氏鲳鲹、尼罗罗非鱼、杂交红罗非鱼，我国的卵形鲳鲹及鲟鱼(俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、史氏鲟、达氏鲟等)等均有感染发病的报道。此外，这三种致病性链球菌均可感染人和多种动物。无乳链球菌常导致新生儿肺炎、脑膜炎、败血症及奶牛乳腺炎；停乳链球菌是牛、猪、羊等家养动物乳房炎、多关节炎、败血症的常见病原菌；人类感染海豚链球菌后可出现包括败血症、中毒性休克综合症和皮肤发炎等症状。因此，实现对三种致病链球菌的快速精准检测，有助于实现鱼类链球菌病的及时监控和快速诊断，保证水产品的质量安全，提升公共卫生水平。传统的生理生化鉴定，是病原鉴定的重要方法，但是该方法步骤繁琐、周期较长、灵敏度低。目前已报道的针对无乳链球菌、海豚链球菌等单一致病菌的PCR检验方法，一次只能检测一种链球菌，检测三种链球菌则需多次实验，工作量大，检测时间长，总体效率低。而在普通单重PCR基础上发展起来的多重PCR(multiplexpolymerasechainreaction,MPCR)可以在一个PCR体系中同时扩增出多个目的DNA片段，以解决单一引物检测能力不足的问题，提高检测效率，节约检测成本。目前，有关所述三种链球菌的检测试剂盒和检测技术虽已有专利申请(申请号：201410425186.5，名称：“同时检测三种链球菌的三重实时荧光PCR方法及试剂盒”)披露，但该申请的试剂盒和检测技术对仪器设备要求较高，试剂耗材昂贵。而本专利技术建立的多重PCR检测方法基于普通PCR反应及检测平台，适用于普通实验室的现有条件，检测成本大幅降低。此外，本专利技术PCR扩增获得的目的DNA片段，亦可用于分子流行病学调查中菌株的基因分型研究。
技术实现思路
本专利技术要解决现有技术检测所述三种鱼源链球菌耗时长，效率低，准确率不高，以及对仪器设备要求高，试剂耗材昂贵等问题，为此提供本专利技术的一种同时检测所述三种链球菌的试剂盒及检测方法，该方法可实现对无乳链球菌、海豚链球菌及停乳链球菌的快速检测和准确鉴别。本专利技术包括一种可同时快速检测无乳链球菌、海豚链球菌及停乳链球菌三种链球菌的试剂盒以及用该试剂盒同时检测所述三种链球菌的方法。本专利技术一种同时检测所述三种链球菌的试剂盒，由DNA提取试剂和PCR反应试剂组成，其特殊之处是所述DNA提取试剂和PCR反应试剂分别为：(1)DNA提取试剂成分为5-15mMTris、0.5-1.5mMEDTA的pH8.0的TE缓冲液；蛋白酶K，浓度15-20mg/mL；100％的氯仿；100％的异丙醇；乙醇，浓度70％；双蒸水；(2)PCR反应试剂分装于若干PCR反应管，每个PCR反应管中含有10×PCR反应缓冲液2.5μL，浓度为10μM的dNTPs0.5μL，浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶0.3μL，浓度为10μM的特异性寡核苷酸引物Sa.tkt-F0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sa.tkt-R0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sd.AtoB-F0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sd.AtoB-R0.25μL,10μM的特异性寡核苷酸引物Si.RecA-F0.75μL,10μM的特异性寡核苷酸引物Si.RecA-R0.75μL，灭菌去离子水18.2μL，所述引物及其核苷酸序列为：检测无乳链球菌的上下游引物—引物Sa.tkt-F:5’-GTGCTGGCATAGATACGACG-3’,引物Sa.tkt-R:5’-CGCTTCACGGTGGGACT-3’,检测停乳链球菌的上下游引物—引物Sd.AtoB-F:5’-TAGGACAAAATGTGGCAAGAC-3’,引物Sd.AtoB-R:5’-GTCCAGTTCCCATCAGTTCAG-3’,检测海豚链球菌的上下游引物—引物Si.RecA-F:5’-TAAGGGTGCTGTTATGCGTCT-3’,引物Si.RecA-R:5’-CAGGCGTTGTTTCAGGGTTA-3’。本专利技术用所述的试剂盒同时检测无乳链球菌、海豚链球菌和停乳链球菌的方法，步骤为：(1)用所述提取试剂提取样品中的DNA；(2)用所述反应试剂对所述DNA作PCR扩增；(3)所述扩增产物作凝胶电泳；其特殊之处是所述PCR扩增过程为95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min；循环35次，最后72℃延伸5～10min；所述凝胶电泳后观察到495bp、566bp、699bp扩增产物。本专利技术中所设计的分别针对无乳链球菌、海豚链球菌及无乳链球菌的多重PCR特异性检测引物，系根据GenBank上已公布的链球菌的看家基因序列，结合相关文献报道，选择在本属内相对保守而种间同源性较低的基因：无乳链球菌tkt基因，海豚链球菌RecA基因，停乳链球菌AtoB基因，分别为各自的引物设计区。各引物均通过Blast对比分析及特异性试验验证，能够很好的区分与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌。同时，上述靶基因亦是三种链球菌MLST分型研究的目标基因之一，因此，本专利技术多重PCR引物扩增获得的目的片段，还可用于分子流行病学调查中菌株的基因分型研究。本专利技术的有益效果在于：本专利技术建立的多重PCR检测方法是一种基于普通PCR平台的检测方法，对检测平台和检测人员的要求低，检测通量高，试剂耗材成本低，该检测方法简便、快速、灵敏度高、特异性强。适用于水生动物链球菌的快速检测及大规模分子流行病学调查分析、水产品的质量安全及检验检疫等多种检测需求。本专利技术的方法在于快速、简便地检测所述三种链球菌，不以人或动物疾病的诊断和治疗为目的。附图说明图1为无乳链球菌特异性检测结果；其中，M-DNAmarker1000；1-无乳链球菌；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测无乳链球菌、海豚链球菌及停乳链球菌的引物组合，其成分及其核苷酸序列如下：/n检测无乳链球菌的上下游引物—/n引物Sa.tkt-F:5’-GTGCTGGCATAGATACGACG-3’,/n引物Sa.tkt-R:5’-CGCTTCACGGTGGGACT-3’,/n检测停乳链球菌的上下游引物—/n引物Sd.AtoB-F:5’-TAGGACAAAATGTGGCAAGAC-3’,/n引物Sd.AtoB-R:5’-GTCCAGTTCCCATCAGTTCAG-3’,/n检测海豚链球菌的上下游引物—/n引物Si.RecA-F:5’-TAAGGGTGCTGTTATGCGTCT-3’,/n引物Si.RecA-R:5’-CAGGCGTTGTTTCAGGGTTA-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时检测无乳链球菌、海豚链球菌及停乳链球菌的引物组合，其成分及其核苷酸序列如下：
检测无乳链球菌的上下游引物—
引物Sa.tkt-F:5’-GTGCTGGCATAGATACGACG-3’,
引物Sa.tkt-R:5’-CGCTTCACGGTGGGACT-3’,
检测停乳链球菌的上下游引物—
引物Sd.AtoB-F:5’-TAGGACAAAATGTGGCAAGAC-3’,
引物Sd.AtoB-R:5’-GTCCAGTTCCCATCAGTTCAG-3’,
检测海豚链球菌的上下游引物—
引物Si.RecA-F:5’-TAAGGGTGCTGTTATGCGTCT-3’,
引物Si.RecA-R:5’-CAGGCGTTGTTTCAGGGTTA-3’。


2.一种同时检测权利要求1所述三种链球菌的试剂盒，由DNA提取试剂和PCR反应试剂组成，其特征是所述DNA提取试剂和PCR反应试剂分别为：
(1)DNA提取试剂成分为5-15mMTris、0.5-1.5mMEDTA的pH8.0的TE缓冲液；蛋白酶K，浓度15-20mg/mL；100％的氯仿；100...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔺凌云，潘晓艺，沈锦玉，姚嘉赟，尹文林，曹铮，刘忆瀚，夏焱春，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33