一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品制造技术

本发明专利技术涉及一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品，包括异源菌株宿主以及包含结核分枝杆菌特定核酸序列的外源特征序列。本发明专利技术消除了直接使用结核分枝杆菌致病菌作为质控品所存在的生物安全风险；理论上可以模拟具有任意一种靶标序列特征的结核分枝杆菌供

【技术实现步骤摘要】
一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品
本专利技术属于结核分枝杆菌分子检测领域，特别涉及一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品。
技术介绍
根据世界卫生组织(WHO)估计全球有一亿左右结核病患者，每年有150万人因此死亡，是死亡人数最多的单一病原传染病(高于HIV)。结核病由结核分枝杆菌引起，它的防治难点在于容易产生耐药。近年来耐药菌株引发的结核病例快速增加，每年由多耐药菌株(MDR-TB，对利福平和异烟肼耐药)引发的病例超过50万，其中一部分还是广泛耐药菌株(XDR-TB，多耐药基础上拮抗其他2线治疗抗生素)甚至全耐药菌株(TDR-TB，拮抗目前已知治疗药物)。此外，结核分枝杆菌生长缓慢，传统细菌培养方法检测需要数周，给及时诊治带来困难。相较于镜检、培养等传统检测手段动辄需要数周乃至数月，以结核分枝杆菌核酸(DNA或RNA)序列为检测靶标的分子检测技术，只需几天甚至数小时即能确定是否结核分枝杆菌感染，一些检测方法还能提供菌株的药敏信息。比如美国Cepheid公司推出的MTB/RIF检测(配合Dx系统使用，以下简称Xpert系统)，可在2小时内从痰液样本中给出是否感染，以及是否利福平耐药的检测结果。而超过90％拮抗利福平的菌株会同时拮抗异烟肼，因此利福平耐药是MDR-TB的重要前瞻指标。2010年起，Xpert系统被WHO推荐用于结核病诊断，已是目前应用最为广泛的快速诊断方法。同时，其它以核酸为靶标的分子检测方法也已在我国各级医疗机构得到推广应用，如基于DNA特征序列的PCR-荧光探针法、微阵列芯片法、环介导恒温扩增法，基于结核分枝杆菌RNA特征序列的RNA恒温扩增检测法等。其中RNA恒温扩增检测法具有灵敏度高、检测迅速、设备要求低的特点，并且只对活菌敏感而不受死亡细菌干扰，可以更及时地反映药物治疗效果，是今后检测技术的重要发展方向之一。而对这些核酸检测方法检测质量的监督和管理，需要用到相应的室内/室间质控品。通常是以灭活后的结核分枝杆菌作为质控品，但是该方法存在潜在的生物安全风险。并且结核分枝杆菌大量培养，需要在三级生物安全(BSL-3)实验室进行，实验条件要求严苛。而常规处理条件下，灭活后的菌株RNA发生降解，无法作为RNA质控品使用。此外，结核分枝杆菌菌种在运输和入境过关中存在诸多限制，难以收集多种基因型菌株供质控使用。如Xpert系统以rpoB基因(编码RNA聚合酶β亚基，β-SubunitofRNApolymerase)的81bp核心序列为检测靶标，有5个探针对其进行检测，理论上存在32种不同的探针组合，需要32种不同的质控品才能对其作最为全面的质控。实际上，自然界目前发现的这一区段的突变子数要远少于32种，而这些不同的突变子还分布于全世界各地，鉴于致病菌株的严格管控，收集齐备这些不同基因型菌株只存在理论可能，因此依靠病原菌株收集难以满足质控品的多样性需要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品，消除直接使用结核分枝杆菌致病菌带来的潜在生物安全风险,同时可供当前主流核酸检测方法(Xpert系统)以及具有发展优势的检测方法(RNA恒温扩增检测)使用的质控品。并且可针对特定检测方法(Xpert系统)，提供多种特征序列供质控使用以充分验证仪器性能。本专利技术提供了一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品，包括异源菌株宿主以及包含结核分枝杆菌特定(如种属特性、特定药敏性状等)核酸序列的外源特征序列。所述异源菌株宿主选取合适的非致病菌、如非致病的大肠杆菌等。所述异源菌株宿主可以提供类似结核分枝杆菌的细菌细胞结构；细胞结构可为导入的外源序列提供一定物理保护，以及避免被体外核酸酶降解等；可以模拟细菌核酸的提取过程。所述外源特征序列选自用于表征种属特征的16S-rDNA序列、菌株耐药性相关的rpoB基因序列中的一种或者两者的组合。所述外源特征序列的获得方式包括从原宿主菌中扩增获得、从已知克隆中分离以及人工合成中的一种或几种。所述质控品以异源菌株宿主为载体，通过导入或整合包含结核分枝杆菌部分核酸特征序列的外源核酸片段制备而成。所述整合包括以单拷贝或多拷贝方式整合于染色体和/或整合于严谨型或松弛性质粒中。所述质控品不仅用于以DNA为靶标的核酸检测还可用于以RNA为靶标的核酸检测。当所述质控品需要作为RNA质控使用时，会在制备之初加入RNA保护剂以防止RNA降解。通常RNA保护剂还会继续存在于所述质控品基质中。所述质控品的检测方式包括Xpert系统或者其它以rpoB基因的部分序列为检测靶标的核酸检测方法，或者以16S-rDNA/rRNA序列为检测靶标的核酸检测方法，这些核酸检测靶标可以是DNA也可以是这些序列转录形成的RNA。有益效果本专利技术消除了直接使用结核分枝杆菌致病菌作为质控品所存在的生物安全风险；理论上可以模拟具有任意一种靶标序列特征的结核分枝杆菌供MTB/RIF系统(配合Dx系统)及基于类似检测靶标的检测系统质控使用；作为Xpert系统质控品，可以为其提供针对每个探针和各种探针组合的质控品，为其提供全面的质控保障；所制备的质控品不仅可应用于DNA检测质控还可用于RNA检测质控；制备方便，适合商业化应用。附图说明图1为TOP10(a)、rif-s(b)、rif-r(c)菌株的Xpert系统检测结果。图2为各模拟菌株Xpert系统检测结果及响应探针。图3为各模拟菌株Xpert系统检测结果及响应探针。图4为不同丰度质控品的检出。图5a-b为RNA恒温扩增检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(第四版，科学出版社，2017)等本领域常用工具书中所述方法进行，或按照试剂生产厂家建议条件进行。实施例1一、本实施例提供了一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌质控品的设计流程，需要说明的是，实施例仅为举例，其他任意相同结构的质控品均可以此作为参考。具体如下：①首先根据检测仪器检测对象，确定需要导入的特征序列。本实施例选取包含了81bp核心区段(gcaccagccagctgagccaattcatggaccagaacaacccgctgtcggggttgacccacaagcgccgactgtcggcgctgg)的结核分枝杆菌rpoB基因部分序列作为导入序列。②选择合适的非致病性异源宿主，可根据检测仪器的特殊要求选取合适的宿主。本实施例选取了遗传操作方便、快速生长、非致病的大肠杆菌DH5α及TOP10菌株作为异源宿主。③将特征序列导入并稳定地存在于异源宿主菌中。可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品，其特征在于：包括异源菌株宿主以及包含结核分枝杆菌特定核酸序列的外源特征序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品，其特征在于：包括异源菌株宿主以及包含结核分枝杆菌特定核酸序列的外源特征序列。


2.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于：所述异源菌株宿主为非致病菌。


3.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于：所述外源特征序列选自结核分枝杆菌16S-rDNA的部分序列或者耐药性相关基因rpoB中的部分序列，或是两者的组合。


4.根据权利要求1或3所述的质控品，其特征在于：所述外源特征序列的获得方式包括从原宿主菌中扩增获得、从已知克隆中分离以及人工合成中的一种或几种。


5.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于：所述质控品以异源菌株宿主为载体，通过导入或整合包含结核分枝杆菌部分核酸特征序列的外源核酸片段制备而成。


6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：范云，韩雪菲，黄维纲，王华梁，
申请(专利权)人：上海市临床检验中心，
类型：发明
国别省市：上海;31