一种基于CRISPR/Cas12a的KRAS热点基因突变检测系统和方法技术方案

本发明专利技术涉及一种基于CRISPR/Cas12a的KRAS热点基因突变检测系统和方法，所述检测系统包括针对KRAS热点突变基因的重组酶聚合酶扩增RPA引物、crRNA、LbaCas12a和单链DNA荧光报告基团。本发明专利技术对仪器设备需求低、操作简便、通用性强且准确性高；利用本发明专利技术的检测系统能够快速实现对KRAS热点基因突变检测，且能够高特异性地鉴定SNV突变。性地鉴定SNV突变。性地鉴定SNV突变。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas12a的KRAS热点基因突变检测系统和方法


[0001]本专利技术属于基因检测领域，特别涉及一种基于CRISPR/Cas12a的KRAS热点基因突变检测系统和方法。

技术介绍

[0002]鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)是细胞信号通路的关键基因之一，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一。KRAS基因编码的RAS蛋白与GTP结合后具有GTP酶活性，可激活细胞内外信号通路，从而调控细胞生长表达等重要生命过程。KRAS基因发生突变时无需EGFR(epidermal growth factor receptor)接受信号，能够自动活化该通路并启动下游的信号转导，导致细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控。KRAS基因突变发生在肿瘤早期，且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致。有研究表明，90％的KRAS基因突变发生在2号外显子的12密码子和13密码子位点，其最常见高频突变类型为点突变，如c.35G>T，c.34G>T，c.38G>A，c.35G>A，c.35G>C，c.34G>C等。上述突变破坏了KRAS蛋白内在的GTPase活性，从而使得KRAS蛋白处于持续活性状态。一般认为，KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。已有研究表明，KRAS基因突变分析是非小细胞肺癌(NSCLS)和结直肠癌(CRC)治疗和诊断的重要环节，KRAS基因状态会影响相关肿瘤治疗过程中的药效。因此，KRAS基因突变状态的检测对于肿瘤诊断和监测，还有靶向药物的选择都具有重要意义。
[0003]目前临床应用的KRAS基因突变检测方法主要有扩增阻滞突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS
‑
PCR)、流式技术的磁珠乳液扩增方法(bead,emulsion,amplification and magnetic,BEAMing)、数字化PCR(Digital PCR，dPCR)和高通量测序(next
‑
generation sequencing，NGS)等，但上述方法存在操作复杂、设备昂贵且人员需专业培训等问题。因此，亟需提供一种操作简单、成本低廉，且灵敏度高、特异性强的KRAS热点基因突变检测方法，对于相关肿瘤的早期检测、用药指导和预后监测将具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于CRISPR/Cas12a的KRAS热点基因突变检测系统和方法。该检测系统对仪器设备需求低、操作简便、通用性强且准确性高；能够快速实现对KRAS热点基因突变检测，且能够高特异性地鉴定SNV突变。
[0005]本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas12a的KRAS热点基因突变检测系统，所述检测系统包括针对KRAS热点突变基因的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)引物、crRNA、LbaCas12a和单链DNA荧光报告基团；其中，所述crRNA为特异性KRAS热点基因突变G12C
‑
crRNA，序列如SEQ ID NO:1所示；所述RPA引物包括正向/反向引物G12C
‑
F/R。
[0006]所述G12C
‑
crRNA与原始crRNA相比带有一个额外错配碱基。所述的错配碱基是指，在待测突变位点处有与目标序列不互补的错配碱基。所述crRNA可通过构建体外转录载体并进行体外转录和纯化制得，或者直接合成。
[0007]所述G12C
‑
F/R的序列如SEQ ID NO:2～3所示。所述G12C
‑
F/R引物是通过相关引物设计原则筛选出来的高效特异序列，其中G12C
‑
F序列中带有非典型PAM序列(GTTG)。
[0008]所述LbaCas12a可经重组表达纯化获得或使用NEB等公司提供的商品化LbaCas12a产品。
[0009]所述单链DNA荧光报告基团的序列如下所示：5'
‑6‑
FAM
‑
TTTTT
‑
IABkFQ
‑
3'。
[0010]本专利技术还提供了一种基于CRISPR/Cas12a的KRAS热点基因突变检测方法，包括：
[0011]采用所述RPA引物对待测核酸样本进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；将crRNA、RPA扩增产物、LbaCas12a、单链DNA荧光报告基团混合于反应体系中进行反应；反应产物通过荧光检测获得检测结果。
[0012]所述反应体系为20μL，0.5μl的crRNA、1.0μl的LbaCas12a、2μl 10
×
NEBuffer
TM 2.1、2μl单链DNA荧光报告基团、5μl的RPA扩增产物和9.5μl的水。
[0013]所述反应条件为37℃10～60分钟。
[0014]所述待测核酸样本可以是从临床样本中抽提的核酸，或以其他核酸检测手段中样本处理方法处理过的样品。
[0015]所述荧光检测所用装置可为任何能在FAM荧光通道上进行荧光激发并检测的荧光检测装置，或通过蓝光照射进行裸眼可视化观察。
[0016]有益效果
[0017](1)本专利技术与现有其它检测技术相比，所述方法只需恒温装置和简易荧光读取装置或裸眼直接观察，操作简单，检测速度快，在KRAS热点基因突变检测中表现出良好性能，能够对低丰度的KRAS热点基因突变位点进行准确检测，具有良好应用前景。
[0018](2)本专利技术方法中通过RPA的高效扩增能力产生大量扩增产物，上述扩增产物可被Cas12a所特异识别，识别过程中需相应PAM位点，利用非典型PAM位点方式可解决部分靶标突变序列处无PAM位点的问题，大大增加了本专利技术方法的通用性；同时CRISPR/Cas12a的高特异性和自我放大能力又进一步提高了传感性能，特别是通过crRNA错配碱基方式可实现高效区分SNV位点的目的，从而使所述检测方法具有准确性好、灵敏度高、选择性强、抗干扰能力强、重复性好等优点。
附图说明
[0019]图1为应用非典型PAM位点进行CRISPR/Cas12a检测的可行性分析结果。
[0020]图2为KRAS热点基因突变G12C检测的荧光信号强度和裸眼观察结果。
[0021]图3为KRAS热点基因突变G12C检测灵敏度(A)和选择性(B)分析结果图。
[0022]图4为KRAS热点基因突变G12C检测特异性分析结果图。
[0023]图5为CRISPR/Cas12a荧光检测方法的临床应用。
具体实施方式
[0024]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12a的KRAS热点基因突变检测系统，其特征在于：所述检测系统包括针对KRAS热点突变基因的重组酶聚合酶扩增RPA引物、crRNA、LbaCas12a和单链DNA荧光报告基团；其中，所述crRNA为特异性KRAS热点基因突变G12C
‑
crRNA，序列如SEQ ID NO:1所示；所述RPA引物包括正向/反向引物G12C
‑
F/R。2.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于：所述G12C
‑
crRNA与原始crRNA相比带有一个额外错配碱基。3.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于：所述G12C
‑
F/R的序列如SEQ ID NO:2～3所示。4.根据权利要求3所述的检测系统，其特征在于：所述G12C
‑
F带有非典型PAM位点GTTG。5.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雪亮，范晓瑜，史春丽，肖艳群，胡晓波，
申请(专利权)人：上海市临床检验中心，
类型：发明
国别省市：