一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法，通过将糖化血红蛋白HbA1c的核酸适配体与血红蛋白Hb的核酸适配体分别与电信号分子二茂铁链接，再通过巯基自组装固定在丝网印刷电极上得到核酸适配体生物传感器；当适配体识别相应的目标蛋白之后，电极表面猝灭二茂铁的电流信号，电信号发生变化，采用差分脉冲伏安法(DVP)和阻抗法测试电极信号变化程度，从而达到检测糖化血红蛋白浓度的目的。本发明专利技术与现有技术的糖化血红蛋白检测方法相比较，具有特异性强，灵敏度高，快速简便，检测成本低等优点。检测成本低等优点。检测成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法


[0001]本专利技术属于体外诊断
，特别涉及一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法。

技术介绍

[0002]目前，糖化血红蛋白(HbA1c)检测已被多个国家纳入为糖尿病常规检测项目，2010年美国糖尿病协会(ADA)、2011年世界卫生组织(WHO)将HbA1c的血液浓度超过6.5％作为诊断糖尿病的新标准，中华医学会糖尿病学分会(CDS)发布的《中国2型糖尿病防治指南(2020年版)》在有严格质量控制的实验室，采用标准化检测方法测定的糖化血红蛋白可以作为糖尿病的补充诊断标准，诊断标准为≥6.5％。糖化血红蛋白也是监测血糖中、长期控制情况的金标准，因此精准检测糖化血红蛋白，对糖尿病的筛查、早期诊断、治疗和监测并发症具有重要的临床价值。目前临床常规使用的糖化血红蛋白检测方法达30多种。根据国家卫健委临床检验中心和上海市临床检验中心室间质评结果来看，我国的糖化血红蛋白检测标准化程度逐步提高，但各地区差别和方法间差异仍较大，且目前临床实验室使用的糖化血红蛋白测定仪器主要为国外进口，价格昂贵检测成本较高。故需要一种准确快速，又经济实用的检测方法用于糖化血红蛋白的检测。
[0003]目前临床常规使用的糖化血红蛋白检测方法达30多种，主要为色谱法和免疫法，从方法学来看，基于色谱的方法，通过测量糖化血红蛋白(HbA1c)峰面积与血红蛋白(Hb)峰面积之比来确定，由于来自血液基质的各种干扰，使用这些方法可能得到假阳性或阴性结果。而糖化血红蛋白快速检测方法目前主要采用免疫法，使用针对糖化血红蛋白的特异性抗体来定量糖化血红蛋白。也有报道基于场效应晶体管的免疫法、使用硼酸修饰电极的电化学检测糖化血红蛋白，但是，硼酸盐修饰的电极易被血液中的白蛋白识别而引起干扰。另外有报道使用HbA1c抗体作为捕获探针和蛋白(聚糖)结合抗体作为捕获探针的夹心法检测，然而，由于血液样品中其他聚糖部分的干扰和高背景信号，这些方法灵敏度较低。在阵列免疫传感器的研究中，使用针对Hb的多克隆抗体作为共同的捕获探针，会结合所有形式的Hb，并且针对非糖化血红蛋白(HbA0)和HbA1c的特异性单克隆抗体用作检测探针，这种免疫传感器已经消除了聚糖结合分子的使用，因此较好的降低了背景干扰，实现了高灵敏度。然而，免疫测定易受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，且抗体稳定性问题，批间差异，特别是POCT需要即时反应，这些因素导致精准性不好，限制了其应用。前面所述的检测方法虽然能够对糖化血红蛋白进行准确检测，但是设备昂贵，需要人员经过培训后才能操作，操作耗时，检测费用较高，无法现场、在线进行实时监测等不足。
[0004]近年来由于核酸适配体的发展及其相对于抗体的诸多优势，采用适配体为识别原件的生物传感器检测蛋白质得到了广泛的应用。核酸适配体是通过一种体外筛选技术—指数富集配体系统进化技术筛选出来的一种能与蛋白质和小分子物质特异性结合的单链DNA或RNA寡核苷酸片段，一般由25
‑
80个碱基组成。适配体具有高特异性和亲和力，且目标分子范围广，不仅可与大分子(如核酸、蛋白质、多肽等)结合，也能与小分子(如氨基酸、金属离
子等)结合。这就表明适配体为识别元件可明显地拓宽相关传感器的应用范围。适配体比抗体更容易修饰，而且可以在适配体的精确位点进行修饰，并且不影响其亲和力。适配体电化学生物传感器方法，其优势在于：(1)使用适配体可使生物传感器具有较长稳定性；(2)仅需使用几微升血液进行检测；(3)利用适配体和可抛式丝网印刷电极构建的电化学传感器使用便捷，小型化，成本较低，而核酸适配体电化学传感器方法检测成本较低、操作简单、灵敏度高、易于微型化，可对糖化血红蛋白现场、在线检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法，该方法具有特异性强，灵敏度高，快速简便，检测成本低等优点。
[0006]本专利技术提供了一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法，包括：
[0007](1)预先对丝网印刷电极进行预处理；
[0008](2)分别合成糖化血红蛋白HbA1c的核酸适配体与血红蛋白Hb的核酸适配体；所述核酸适配体为单链DNA探针，在DNA核酸单链的3
’
端进行巯基
‑
SH
‑
修饰，5
’
端进行二茂铁基
‑
Fc
‑
修饰；
[0009](3)将HbA1c核酸适配体和Hb核酸适配体稀释，然后加入二硫键还原剂，使溶液终浓度为3
‑
5mmol/L用以还原二硫键，之后进行退火处理；取处理后的适配体溶液，滴至步骤(1)的丝网印刷电极上，室温组装，用缓冲溶液冲洗，晾干，得到HbA1c适配体生物传感器和Hb适配体生物传感器；
[0010](4)采用步骤(3)得到的生物传感器对HbA1c和Hb标准溶液进行检测，建立标准曲线并得到拟合方程；对样品进行差分脉冲伏安法DPV分析，通过建立的标准曲线所得的拟合方程，分别计算出对应的HbA1c和Hb的浓度，通过计算HbA1c和Hb的浓度比值，并换算为糖化血红蛋白NGSP的单位，得到糖化血红蛋白的检测结果。
[0011]所述步骤(1)中的丝网印刷电极为三电极系统，以金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极。
[0012]所述步骤(1)中的丝网印刷电极预处理步骤如下：
[0013]将丝网印刷电极浸入0.05mol/L NaOH溶液中用循环伏安法扫描至稳定扫描范围：
‑
0.3V
‑
1.3V，扫描速度0.1V/s；然后分别在100％乙醇和超纯水中在超声波清洗机中各超声3min，将超声后的电极分别在0.5mmol/L H2SO4溶液、0.1mmol/L KCl，0.5mmol/LH2SO4溶液和0.05mmol/L H2SO4溶液中进行扫描，最后用超纯水冲洗，用N2吹干，备用。
[0014]所述步骤(2)中的糖化血红蛋白核酸适配体和血红蛋白核酸适配体的序列为：
[0015]HbA1c适配体：
[0016]5′‑
GGGGACACAGCAACACACCCACCCACCAGCCCCAGCATCATGCCCATCCGTCGTGTGTG
‑3′
；
[0017]Hb适配体：
[0018]5′‑
ACGCACACCAGAGACAAGTAGCCCCCCAAACGCGGCCACGGAACGCAGCACCTCCAT GGC
‑3′
。
[0019]所述步骤(3)中的核酸适配体稀释溶剂为5mmol/L MgCl2、10mmol/L Tris
‑
HCl溶液。
[0020]所述步骤(3)中的二硫键还原剂为三(2
‑
甲酰乙基)膦盐酸。
[0021]所述步骤(3)中的缓冲溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法，包括：(1)预先对丝网印刷电极进行预处理；(2)分别合成糖化血红蛋白HbA1c的核酸适配体与血红蛋白Hb的核酸适配体；所述核酸适配体为单链DNA探针，在DNA核酸单链的3
’
端进行巯基
‑
SH
‑
修饰，5
’
端进行二茂铁基
‑
Fc
‑
修饰；(3)将HbA1c核酸适配体和Hb核酸适配体稀释，然后加入二硫键还原剂，使溶液终浓度为3
‑
5mmol/L用以还原二硫键，之后进行退火处理；取处理后的适配体溶液，滴至步骤(1)的丝网印刷电极上，室温组装，用缓冲溶液冲洗，晾干，得到HbA1c适配体生物传感器和Hb适配体生物传感器；(4)采用步骤(3)得到的生物传感器对HbA1c和Hb标准溶液进行检测，建立标准曲线并得到拟合方程；对样品进行差分脉冲伏安法DPV分析，通过建立的标准曲线所得的拟合方程，分别计算出对应的HbA1c和Hb的浓度，通过计算HbA1c和Hb的浓度比值，并换算为糖化血红蛋白NGSP的单位，得到糖化血红蛋白的检测结果。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的丝网印刷电极为三电极系统，以金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的丝网印刷电极预处理步骤如下：将丝网印刷电极浸入0.05mol/L NaOH溶液中用循环伏安法...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯雪晴，居漪，贺晓鹏，叶邦策，赵敏，豆伟涛，欧元祝，李卿，金中淦，
申请(专利权)人：上海市临床检验中心，
类型：发明
国别省市：