一种守宫粉提取物的抗病毒用途及其提取方法技术

本发明专利技术公开一种守宫粉提取物的抗病毒用途，抗病毒用途包括以下操作步骤，所述操作步骤如下：S1：选择实验动物、细胞、病毒和提纯后的守宫粉提取物；S2：细胞毒性测定；S3：抗病毒测定；S4：免疫荧光分析；S5：qRT‑PCR；S6：蛋白质印迹；S7：守宫粉提取物对RABV感染小鼠的治疗；S8：得出结论。提取方法包括以下步骤：守宫粉称重加热；抽滤；对抽滤后的提取液浓缩；离心，分离出上清；将上清旋蒸；透析；旋蒸；得粗提物，冷藏保存。本发明专利技术本发明专利技术守宫粉提取物的抗病毒用途，提纯后的守宫粉可用于抑制狂犬病病毒的增殖，能够有效的抑制狂犬病病毒，具有很好的药用价值，可用于制备抗狂犬病病毒药物，提取方法可靠性高、过滤提纯效果好、操作简单可行。

【技术实现步骤摘要】
一种守宫粉提取物的抗病毒用途及其提取方法
本专利技术涉及一种守宫粉提取物的新用途，具体是一种守宫粉提取物的抗病毒用途及其提取方法。
技术介绍
目前针对狂犬病并无有效的治疗药物，守宫是一种小型蜥蜴，常用于中药。可治疗多种恶性肿瘤的临床疗效，此外，它的毒性和副作用比传统化疗药物更少。在中国古籍《本草纲目》和《平安圣方》中，首宫散被推荐用于治疗中风。以其为原料制备的中成药金龙胶胶囊，用于治疗结直肠癌、食管癌、胃癌、肺癌。因此，守宫散具有抗肿瘤和抗病毒作用。从传统中药中筛选具有低毒副作用、易于代谢、无耐药性等优点的抗病毒药物已成为抗病毒药物研究开发的热点之一。本专利技术通过体外和体内模型研究寿宫提取物对狂犬病病毒的抑制作用，现提出一种守宫粉提取物的抗病毒用途及其提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种守宫粉提取物的抗病毒用途及其提取方法，能够有效解决上述问题，本专利技术本专利技术守宫粉提取物的抗病毒用途，提纯后的守宫粉可用于抑制狂犬病病毒的增殖，能够有效的抑制狂犬病病毒，具有很好的药用价值，可用于制备抗狂犬病病毒药物，提取方法可靠性高、过滤提纯效果好、操作简单可行。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种守宫粉提取物的抗病毒用途，抗病毒用途包括以下操作步骤，所述操作步骤如下：S1：选择实验动物、细胞、病毒和提纯后的守宫粉提取物；S2：细胞毒性测定；S3：抗病毒测定；S4：免疫荧光分析；S5：qRT-PCR；S6：蛋白质印迹；S7：守宫粉提取物对RABV感染小鼠的治疗；S8：得出结论，守宫粉提取物的细胞毒性、守宫粉提取物的体外抗病毒作用和守宫粉提取物在体内的抗病毒作用。进一步地，所述S1中，实验动物选用SPF级昆明小鼠、雌性、18-22g，需在实验室中进行3天的适应期；细胞选用BHK-21细胞，在含有5％胎牛血清的培养基中培养；病毒选用RABV株CVS-11，在BHK-21细胞中繁殖，储存在-80℃，病毒滴度确定为50％组织培养物感染剂量(TCID50)/ml。进一步地，所述S2中，细胞毒性测定需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在96孔板中，在37℃下孵育24h，用含各浓度守宫粉提取物(0.69、1.37、2.74、5.47、10.94、21.88和43.75mg)或IPS(0.125、0.25、0.5、1、2、5和10mM)的新鲜培养基替换培养基并孵育48h，用MTS分析评估存活的细胞级分，通过剂量-反应曲线的非线性回归分析确定最大半数细胞毒性浓度(CC50)。进一步地，所述S3中，抗病毒测定需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在96孔板中，并如上所述进行孵育，然后在37℃下用CVS-11(感染复数[MOI]＝0.1)感染1h，PBS洗涤后，新鲜培养基中应含不同浓度的守宫粉提取物(0.69、1.37、2.74、5.47、10.94、21.88和43.75mg)或IPS(0.125、0.25、0.5、1、2、5和10mM)，孵育48h；计算公式为：TCID50评估抗病毒作用：抑制率(％)＝[(对照组病毒滴度-治疗组病毒滴度)/(对照组病毒滴度)]×100％，通过剂量-反应曲线的回归分析计算出50％抑制浓度(IC50)，结果表示为选择性指数(SI＝CC50/IC50)。进一步地，所述S4中，免疫荧光分析需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在96孔板中，24h后将细胞用MOS＝0.1的CVS-11感染，在37℃下孵育1h，PBS洗涤后，添加不同浓度的守宫粉提取物(0、2.74和5.47mg)或IPS(0、0.5和1mM)，在37℃、5％CO2下培养48h，弃培养基，加入50uL/孔80％冷丙酮，然后放入-20℃固定1h，弃固定液，PBS洗涤3次，37℃下与50uL/孔FITC-狂犬病病毒免疫球蛋白，孵育1h，弃抗体，PBST洗涤3次，加入50uL/孔90％甘油缓冲液，荧光显微镜下观察荧光信号并拍照。进一步地，所述S5中，qRT-PCR需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在12孔板中，并用CVS-11感染，用含有不同浓度守宫粉提取物的新鲜培养基代替培养基，孵育48h，使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，Mx3000PQ-PCR系统进行qRT-PCR；所用的引物列于下表中，热循环条件如下：95℃变性30s，95℃下5s和60℃下40个循环1min，靶基因的相对定量采用2-ΔΔCt方法进行，每个反应一式三份，实验重复至少3次。用于qRT-PCR的靶基因引物的序列和大小进一步地，所述S6中，将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在6孔板中，CVS-11感染1h，用含有各浓度守宫粉提取物的新鲜培养基培养，孵育48h，用RIPA裂解液细胞中提取总蛋白质，BCA蛋白质定量测定试剂盒测定蛋白质浓度，QuantumOne软件的成像系统确定蛋白条带强度，内参为α-tubulin。进一步地，所述S7中，将小鼠随机分为8组(n＝10)，CVS-11(20倍LD50)感染其中4组，另外4组用生理盐水处理(对照组)，1h后，分别肌肉注射生理盐水、守宫粉提取物(8.75mg/d)、IPS(1000mg/kg)和直接饲喂守宫粉加工物(每只小鼠进食1g守宫粉/天)；4组对照组，并以相同的方式治疗；连续治疗11天，观察21天。实验结束，取每个小鼠大脑，一半提取RNA用于qRT-PCR，另一半用于FITC标记的单克隆抗RABV核蛋白抗体的免疫组织化学分析，荧光显微镜下观察荧光信号并拍照。进一步地，所述S8中，守宫粉提取物的细胞毒性通过MTS分析评估IPS和守宫粉提取物在BHK-21细胞中的毒性，测量每个样品的光密度，计算相对于对照细胞的存活率。用守宫粉提取物(10.94mg)和IPS(2mM)处理，细胞增殖以时间和剂量依赖性的方式受到抑制，选择5.47mg守宫粉提取物和1mMIPS作为后续实验的工作浓度，在细胞毒性试验中，守宫粉提取物和IPS的CC50分别为28.59mg和3.048mM，在抗病毒测定中，守宫粉提取物和IPS的IC50分别为4023.43mg和1044.91mM，每种处理的SI(CC50/IC50)分别为0.0071和0.0029，IPS和守宫粉提取物以浓度依赖性方式分别降低CVS-11滴度2.5至60倍和3.7至70倍，结果表明两种药物在体外均具有显着的抗RABV作用；守宫粉提取物的体外抗病毒作用通过免疫荧光分析、qRT-PCR和western评估守宫粉提取物在感染了CVS-11的BHK-21细胞中的抗病毒作用，守宫粉提取物或IPS处理感染的细胞会导致绿色荧光信号的浓度依赖性降低(Fig3a)，表明病毒复制受到抑制，与对照组相比，守宫粉提取物和IPS以浓度依赖的方式使CVS-11的N，P，M，G和L基因的表达降低了28.8％-45.0％(P<0.05)和50.1％-59.0％(P<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种守宫粉提取物的抗病毒用途，抗病毒用途包括以下操作步骤，其特征在于，所述操作步骤如下：/nS1：选择实验动物、细胞、病毒和提纯后的守宫粉提取物；/nS2：细胞毒性测定；/nS3：抗病毒测定；/nS4：免疫荧光分析；/nS5：qRT-PCR；/nS6：蛋白质印迹；/nS7：守宫粉提取物对RABV感染小鼠的治疗；/nS8：得出结论，守宫粉提取物的细胞毒性、守宫粉提取物的体外抗病毒作用和守宫粉提取物在体内的抗病毒作用。/n

【技术特征摘要】
1.一种守宫粉提取物的抗病毒用途，抗病毒用途包括以下操作步骤，其特征在于，所述操作步骤如下：
S1：选择实验动物、细胞、病毒和提纯后的守宫粉提取物；
S2：细胞毒性测定；
S3：抗病毒测定；
S4：免疫荧光分析；
S5：qRT-PCR；
S6：蛋白质印迹；
S7：守宫粉提取物对RABV感染小鼠的治疗；
S8：得出结论，守宫粉提取物的细胞毒性、守宫粉提取物的体外抗病毒作用和守宫粉提取物在体内的抗病毒作用。


2.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S1中，实验动物选用SPF级昆明小鼠、雌性、18-22g，需在实验室中进行3天的适应期；
细胞选用BHK-21细胞，在含有5％胎牛血清的培养基中培养；
病毒选用RABV株CVS-11，在BHK-21细胞中繁殖，储存在-80℃，病毒滴度确定为50％组织培养物感染剂量(TCID50)/ml。


3.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S2中，细胞毒性测定需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在96孔板中，在37℃下孵育24h，用含各浓度守宫粉提取物(0.69、1.37、2.74、5.47、10.94、21.88和43.75mg)或IPS(0.125、0.25、0.5、1、2、5和10mM)的新鲜培养基替换培养基并孵育48h，用MTS分析评估存活的细胞级分，通过剂量-反应曲线的非线性回归分析确定最大半数细胞毒性浓度(CC50)。


4.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S3中，抗病毒测定需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在96孔板中，并如上所述进行孵育，然后在37℃下用CVS-11(感染复数[MOI]＝0.1)感染1h，PBS洗涤后，新鲜培养基中应含不同浓度的守宫粉提取物(0.69、1.37、2.74、5.47、10.94、21.88和43.75mg)或IPS(0.125、0.25、0.5、1、2、5和10mM)，孵育48h；
计算公式为：TCID50评估抗病毒作用：抑制率(％)＝[(对照组病毒滴度-治疗组病毒滴度)/(对照组病毒滴度)]×100％，通过剂量-反应曲线的回归分析计算出50％抑制浓度(IC50)，结果表示为选择性指数(SI＝CC50/IC50)。


5.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S4中，免疫荧光分析需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在96孔板中，24h后将细胞用MOS＝0.1的CVS-11感染，在37℃下孵育1h，PBS洗涤后，添加不同浓度的守宫粉提取物(0、2.74和5.47mg)或IPS(0、0.5和1mM)，在37℃、5％CO2下培养48h，弃培养基，加入50uL/孔80％冷丙酮，然后放入-20℃固定1h，弃固定液，PBS洗涤3次，37℃下与50uL/孔FITC-狂犬病病毒免疫球蛋白，孵育1h，弃抗体，PBST洗涤3次，加入50uL/孔90％甘油缓冲液，荧光显微镜下观察荧光信号并拍照。


6.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S5中，qRT-PCR需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在12孔板中，并用CVS-11感染，用含有不同浓度守宫粉提取物的新鲜培养基代替培养基，孵育48h，使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，Mx3000PQ-PCR系统进行qRT-PCR；
所用的引物列于下表中，热循环条件如下：95℃变性30s，95℃下5s和60℃下40个循环1min，靶基因的相对定量采用2-ΔΔCt方法进行，每个反应一式三份，实验重复至少3次。
用于qRT-PCR的靶基因引物的序列和大小





7.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S6中，将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在6孔板中，CVS-11感染1h，用含有各浓度守宫粉提取物的新鲜培养基培养，孵育48h，用RIPA裂解液细胞中提取总蛋白质，BCA蛋白质定量测定试剂盒测定蛋白质浓度，QuantumOne软件的成像系统确定蛋白条带强度，内参为α-tubulin。


8.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S7中，将小鼠随机分为8组(n＝10)，CVS-11(20倍LD50)感染其中4组，另外4组用生理盐水处理(对照组)，1h后，分别肌肉注射生理盐水、守宫粉提取物(8.75mg/d)、IPS(1000mg/kg)和直接饲喂守宫粉加工物(...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华梁，张敏敏，范云，王雪亮，王敬华，陈蓉，潘沪生，肖艳群，王鹤尧，黄维刚，
申请(专利权)人：上海市临床检验中心，
类型：发明
国别省市：上海;31