一种基于CRISPR/Cas12a的肺癌患者外周血EGFR基因突变检测系统和方法技术方案

本发明专利技术涉及一种基于CRISPR/Cas12a的肺癌患者外周血EGFR基因突变检测系统和方法，所述检测系统包括针对EGFR突变基因的重组酶聚合酶扩增RPA引物、crRNA、LbaCas12a和单链DNA荧光报告基团。本发明专利技术的检测系统可快速、准确地鉴定外周血样本中EGFR基因突变序列和其野生型序列，同时具有通用性、快速、高灵敏度和低成本的特点。本的特点。本的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas12a的肺癌患者外周血EGFR基因突变检测系统和方法


[0001]本专利技术属于基因检测领域，特别涉及一种基于CRISPR/Cas12a的肺癌患者外周血EGFR基因突变检测系统和方法。

技术介绍

[0002]肺癌是我国发病率和致死率最高的恶性肿瘤，其中80％为非小细胞肺癌(non
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small cell lung cancer，NSCLC)。传统肺癌治疗手段以放疗和化疗为主，但其特异性较差且有较大副作用，而以肿瘤细胞增殖分化相关的信号转导通路的关键酶为作用靶点的药物已成为NSCLC治疗的重要方向。针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突变而设计的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)目前已广泛应用于临床，可显著提高患者生存效益、延长患者生存期，改善患者生活质量。
[0003]EGFR是一种具有酪氨酸激酶活性的膜表面受体，广泛存在于人体表皮细胞，在多种上皮源性肿瘤中存在高表达，并与肿瘤增殖、血管形成、侵袭转移等有关。EGFR的突变或异常表达所引起的信号传导失控与肿瘤的发生、发展密切相关，目前发现约10％～40％的NSCLC患者发生EGFR基因突变。EGFR突变主要发生在胞内TK区域前四个外显子上(exon18、19、20、21)，其突变类型及位点多达30多种，包括不依赖配体的EGFR
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TK激活突变和耐药突变。EGFR激活突变主要有三种类型：缺失、替代、复制或插入，其中90％突变类型是外显子19的缺失突变del E746
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A750和外显子21上的替代突变L858R，此两处热点突变可使患者对酪氨酸激酶的敏感性大大提高，是评价TKI疗效的有效预测指标。近些年多项临床试验已证实针对EGFR突变基因的靶向治疗在肺癌治疗中具有显著效果，有效延长了患者的无进展生存期并提高其生活质量。但在治疗过程中，一些耐药基因的出现可能对治疗效果产生重大影响，其中约50％的获得性耐药是由外显子20的T790M突变所致。因此，在治疗前准确了解EGFR基因突变状态，在治疗中持续监测耐药基因突变情况，对NSCLC的个体化精准治疗具有重要意义。
[0004]组织活检是目前癌症基因分型的金标准，但由于肿瘤异质性和疾病进展，组织活检具有一定局限性。基于外周血中循环肿瘤DNA(Circulating Tumor DNA，ctDNA)的液体活检可用于肿瘤早期诊断、预后监测和药物疗效监测。目前临床应用的主要方法有扩增阻滞突变系统PCR、流式技术的磁珠乳液扩增方法、数字化PCR和高通量测序等，但上述方法存在操作复杂、设备昂贵且人员需专业培训等问题。
[0005]作为“下一代分子诊断”的CRISPR/Cas技术，具有快速、便携、成本低廉、灵敏度高、特异性强等优点，已被证明可用于病原体检测、耐药性分析、SNP分型、肿瘤基因突变检测等多种用途。如以张峰团队发现的Ⅱ型Cas12a为例，在crRNA引导下Cas12a蛋白可特异性识别并切割靶基因，随后激活Cas12a的反式切割活性。基于该原理，将带有荧光基团的ssDNA片段加入反应体系后，通过荧光信号的释放提示靶基因存在，可鉴定样本中是否含有所待测靶基因。但当前已建立的CRISPR/Cas12a系统仍面临两个问题：一是部分突变基因，如EGFR
基因T790M突变序列处无Cas12a酶识别所需的PAM位点，这将导致Cas12a蛋白无法识别切割靶标核酸；二是无法高特异性地检测某些特定基因突变，如单核苷酸变异(Single Nucleotide Variant,SNV)，这极大地限制了其临床应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于CRISPR/Cas12a的肺癌患者外周血EGFR基因突变检测系统和方法，该检测系统可快速、准确地鉴定外周血样本中EGFR基因突变序列和其野生型序列，同时具有通用性、快速、高灵敏度和低成本的特点。
[0007]本专利技术提供了一种肺癌患者外周血EGFR基因突变检测系统，所述检测系统包括针对EGFR突变基因的重组酶聚合酶扩增RPA(Recombinase Polymerase Amplification)引物、crRNA、LbaCas12a和单链DNA荧光报告基团；其中，所述crRNA包括特异性EGFR基因缺失突变ΔE746
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A750
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crRNA或点突变T790M
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crRNA，序列如SEQ ID NO:1或2所示；所述RPA引物包括正向/反向引物ΔE746
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A750
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F/R或T790M
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F/R。
[0008]所述T790M
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crRNA与原始crRNA相比带有一个额外错配碱基。所述的错配碱基是指，在待测突变位点处有与目标序列不互补的错配碱基。所述crRNA可通过构建体外转录载体并进行体外转录和纯化制得，或者直接合成。
[0009]所述ΔE746
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A750
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F/R的序列如SEQ ID NO:3～4所示；所述T790M
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F/R的序列如SEQ IDNO:5～6所示，所述T790M
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F引物通过碱基突变方式引入TTTN的PAM位点。所述RPA引物是通过相关引物设计原则筛选出来的高效特异序列。本专利技术针对EGFR热点基因突变(ΔE746
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A750和T790M)设计RPA引物，考虑T790M突变位点附近无PAM序列，故在设计RPA引物时利用碱基突变方式引入带有TTTN的PAM位点。
[0010]所述单链DNA荧光报告基团的序列如下所示：5'
‑6‑
FAM
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TTTTT
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IABkFQ
‑
3'。
[0011]所述LbaCas12a可经重组表达纯化获得或使用NEB等公司提供的商品化LbaCas12a产品。
[0012]本专利技术提供了一种肺癌患者外周血EGFR基因突变检测方法，包括：
[0013]采用所述RPA引物对待测核酸样本进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；将crRNA、RPA扩增产物、LbaCas12a、单链DNA荧光报告基团混合于反应体系中进行反应；反应产物通过荧光检测获得检测结果。
[0014]所述反应体系为20μL，0.5μl的crRNA(10μM)、1.0μl的LbaCas12a(10μM)、2μl10
×
NEBuffer
TM
2.1、2μl单链DNA荧光报告基团(10μM)、5μl的RPA扩增产物和9.5μl的水。
[0015]所述反应条件为37℃10～60分钟。优选为10～30分钟。
[0016]所述待测核酸样本可以是从临床样本中抽提的核酸，或以其他核酸检测手段中样本处理本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12a的肺癌患者外周血EGFR基因突变检测系统，其特征在于：所述检测系统包括针对EGFR突变基因的重组酶聚合酶扩增RPA引物、crRNA、LbaCas12a和单链DNA荧光报告基团；其中，所述crRNA包括特异性EGFR基因缺失突变ΔE746
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A750
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crRNA或点突变T790M
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crRNA，序列如SEQ ID NO:1或2所示；所述RPA引物包括正向/反向引物ΔE746
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A750
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F/R或T790M
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F/R。2.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于：所述T790M
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crRNA与原始crRNA相比带有一个额外错配碱基。3.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于：所述ΔE746
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A750
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F/R的序列如SEQ ID NO:3～4所示。4.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于：所述T790M
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F/R的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雪亮，宋见，范晓瑜，史春丽，肖艳群，胡晓波，
申请(专利权)人：上海市临床检验中心，
类型：发明
国别省市：