一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法技术

本发明专利技术提供一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法，使用常规基因组DNA提取试剂盒抽取样本基因组，使用通用引物16s rRNA

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法


[0001]本专利技术属于家禽领域，涉及一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法，是一种基于PCR
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RFLP技术和500bp左右线粒体16s rRNA片段长度多态性鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及皮革的方法，对规范家禽皮张市场及出土皮革文物鉴定具有重要意义。

技术介绍

[0002]天然皮革由动物皮张经过十分复杂的物理加工和化学处理制作而成，牢固耐用、透气性好、高雅舒适并具有良好的生态特性，可用于制作衣服、鞋子、腰带、沙发、皮包、仪表等多种生活用品，备受人们的喜爱。猪皮、牛皮和羊皮产量大且质量较好，是制革的主要原料，因而常见天然皮革主要有猪皮革、牛皮革和羊皮革。不同皮革的特性存在差异，其用途和市场价值也不相同。猪皮革透气性和耐用性较好，但弹性较差，可用于制作内衣等；黄牛皮革的弹性和耐用性较好，在市场上的重要程度较高，可用于制作服装、篮球等；水牛皮革抗张强度较高，但质地和耐磨性较差，强度较黄牛皮革低，可用于制作鞋底等；山羊皮革柔软性能好，但耐用性较差，坚牢性比牛皮革和猪皮革差，可用于制作软包等；绵羊皮革柔软性比山羊皮好，但耐用性差，强度较低，坚牢性比山羊皮革差，可用于制作软包、手套等。一直以来，鉴别皮革材质问题一直是广大消费者及质检部门关注的焦点。目前，鉴定真假皮革技术较为成熟，但鉴定皮革种类仍是有待攻克的难点。理论上，可以根据皮革表面毛孔的粗细、疏密和分布情况等粒面特征，以及革内胶原纤维的粗细等物理特征区分猪皮革、牛皮革和羊皮革，但皮革复杂的加工过程会掩盖或破坏这些物理特征，导致难以辨认皮革种类。此外，许多出土皮革文物由于长时间埋在地底下，受雨水浸泡、物理挤压、微生物腐蚀等多种因素影响，内部结构变化大，难以通过物理特征辨别其类别，对国家考古工作造成困扰。另外，借助常用仪器分析对检测人员的专业知识和经验要求高，且操作复杂，所需时间长，具有较大的局限性。因此，建立一种快速、简便、科学的鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽皮张的方法对规范皮张市场及出土皮革文物鉴定具有重要意义。
[0003]16s rRNA基因相对于线粒体其他基因来说更为保守，常用作物种鉴定的分子遗传标记。聚合酶链式反应
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限制性内切酶长度多态性(PCR
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RFLP)操作简单，快捷，准确性较高，被广泛用于各物种的分子生物学鉴定。目前，基于线粒体16s rRNA片段长度多态性的PCR
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RFLP技术在鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及皮革方面的应用未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法，是一种快速、简便、准确、适用范围广、对设备要求低的鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及皮革的方法。
[0005]本专利技术方法基于PCR
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限制性片段长度多态性技术，同时扩增猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及皮革线粒体16s rRNA的500bp左右片段，根据该片段的核酸位点多态性信息，选用HinfI和VspI两种限制性内切酶进行双酶切，并对酶切产物进行琼脂糖电泳分
型，实现对5种家禽新鲜皮及皮革的鉴定。此外，本专利技术所提出16s rRNA引物的退火温度范围广，且在一定浓度酸碱污染情况下仍能实现有效扩增。本专利技术主要通过以下步骤实现：
[0006](1)抽取基因组DNA：使用常规基因组DNA提取试剂盒抽取猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及植鞣、铁鞣绵羊皮革的基因组DNA，其中铁鞣绵羊皮革的酶解时间需缩短，以免过多铁离子混入基因组，从而抑制后续PCR反应，以提取的基因组DNA为模板扩增16s rRNA片段。
[0007](2)PCR扩增：扩增体系为20μL，包括10μL 2
×
Rapid Taq Master Mix酶，7.8μL ddH2O，0.6μL 16s rRNA
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F引物，0.6μL16s rRNA
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R引物，1μL基因组DNA。反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性25s，58.5℃退火25s，72℃延伸21s，循环38次；72℃延伸7min。
[0008](3)PCR产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小。取5μL PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1
×
TAE，120V恒压电泳20min，凝胶成像系统下拍照，各样本PCR产物的条带大小约为500bp。
[0009](4)酶切：使用HinfI/VspI双酶切PCR产物，酶切体系为20μL，包括10μL PCR产物、6μL ddH2O、2μL Tango缓冲液，以及限制酶HinfI和VspI各1μL，在37℃水浴条件下酶切1h。
[0010](5)酶切产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物大小。取5μL酶切产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1
×
TAE，120V恒压电泳20min，凝胶成像系统下拍照。根据猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽线粒体16s rRNA扩增片段HinfI/VspI双酶切产物电泳图谱，猪皮包括95bp和405bp片段，黄牛皮包括33bp、196bp和277bp片段，水牛皮包括32bp和72bp片段，山羊皮包括95bp、184bp和227bp片段，绵羊皮包括54bp、226bp和227bp片段，其中226bp和227bp重叠在一起，误差约为10bp。
[0011](6)不同退火温度条件下PCR扩增及产物检测：设置18个退火温度，包括46.5℃、47.5℃、48.5℃、49.5℃、50.5℃、51.5℃、52.5℃、53.5℃、54.5℃、55.5℃、56.5℃、57.5℃、58.5℃、59.5℃、60.5℃、61.5℃、62.5℃、63.5℃，按照步骤(2)和(3)方法分别进行PCR扩增和凝胶电泳检测，均得到500bp左右的目的条带。
[0012](7)不同浓度NaOH溶液污染情况下PCR扩增及产物检测：设置0.01％、0.1％、1％和5％四个浓度的NaOH溶液，浸泡猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及植鞣、铁鞣绵羊皮革6h，清水洗净后按照步骤(1)方法抽取基因组，在58.5℃的退火温度条件下进行PCR扩增，凝胶电泳检测后均得到500bp左右的目的条带。
[0013](8)不同浓度HCl溶液污染情况下PCR扩增：设置0.01％、0.1％、1％和5％四个浓度的HCl溶液，浸泡猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及植鞣、铁鞣绵羊皮革6h，清水洗净后按照步骤(1)方法抽取基因组，在58.5℃的退火温度条件下进行PCR扩增，凝胶电泳检测后均得到500bp左右的目的条带。
[0014]本专利技术的另一个目的是提供所述方法在同时鉴定5种家禽新鲜皮及皮革中应用。
[0015]本专利技术首次提出一种能够同时扩增猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及植鞣、铁鞣本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法，其特征在于，基于PCR
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限制性片段长度多态性技术，同时扩增猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及皮革线粒体16s rRNA的500bp左右片段，根据该片段的核酸位点多态性信息，选用HinfI和VspI两种限制性内切酶进行双酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分型，实现对5种家禽新鲜皮及皮革的鉴定。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体通过以下步骤实现：(1)抽取基因组DNA：使用常规基因组DNA提取试剂盒抽取猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及植鞣、铁鞣绵羊皮革基因组DNA，其中铁鞣绵羊皮革的酶解时间为10分钟，以免过多铁离子混入基因组，从而抑制后续PCR反应，以提取的基因组DNA为模板扩增16s rRNA片段；(2)PCR扩增：扩增体系为20μL，包括10μL 2
×
Rapid Taq Master Mix酶，7.8μL ddH2O，0.6μL 16s rRNA
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F引物，0.6μL16s rRNA
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R引物，1μL基因组DNA，反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性25s，58.5℃退火25s，72℃延伸21s，循环38次；72℃延伸7min，得到16s rRNA片段；(3)PCR产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小，凝胶成像系统下拍照，猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及植鞣、铁鞣绵羊皮革PCR产物的条带大小约为500bp；(4)酶切：使用HinfI/VspI双酶切PCR产物，酶切体系为20μL，包括10μL PCR产物、6μL ddH2O、2μL Tango缓冲液，以及限制酶HinfI和VspI各1μL，在37℃水浴条件下酶切1h；(5)酶切产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物大小，凝胶成像系统下拍照，得到猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽线粒体16s rRNA扩增片段HinfI/VspI双酶切产物电泳图谱；(6)不同退火温度条件下PCR扩增及产物检测：设置退火温度，按照步骤(2)方法分别进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，均得到500bp左右的目的条带；(7)不同浓度NaOH溶液污染情况下PCR扩增及产物检测：设置不同浓度的NaOH溶液污染样品后，浸泡猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及植鞣、铁鞣绵羊皮革，清水洗净后抽取基因组，进行PCR扩增，凝胶电泳检测后均得到5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华兵，卢庆宇，郝志华，李颖慧，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：