一种多重呼吸道病毒联合检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种多重呼吸道病毒联合检测试剂盒及其应用，包括核酸扩增反应液、A反应液、B反应液、C反应液、D反应液、临界阳性质控品、强阳性对照和阴性对照。与目前已有呼吸道病毒检测产品相比，本发明专利技术更快速、准确、且覆盖的病毒种类广泛，能够极大缩短检测时间，有效降低检测成本，弥补了现有呼吸道病毒多重联检技术的不足，为临床呼吸道感染的流行病学调查、预防及诊疗提供了便捷手段。预防及诊疗提供了便捷手段。预防及诊疗提供了便捷手段。

【技术实现步骤摘要】
一种多重呼吸道病毒联合检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于临床检测领域，特别涉及一种多重呼吸道病毒联合检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]目前呼吸道病原体检测方法有多种，各有优缺点。所使用的检测技术包括传统的分离培养法、免疫学检测技术以及新兴的分子生物学技术。近年来，随着分子生物学技术的发展及应用，快速检测及鉴别样本中多种呼吸道病毒感染已成为可能。目前以核酸为检测靶标的分子诊断方法因其快速、灵敏、特异、便捷等特点，已成为新一代呼吸道病毒检测的首选方案。在呼吸道感染不同病原体诊断分析中，使用聚合酶链式反应(PCR法)进行病毒核酸检测因其不依赖病毒培养、快速灵敏且特异性高等优点，已逐步在临床得到推广应用。
[0003]当前临床检测多种呼吸道病毒时常使用多个试剂盒分别进行检测实验，增加了实验室检验所需时间及工作量。多重PCR(Multiplex PCR)在常规PCR基础上改进，在同一个反应体系中加入多对特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模版，即可同时在一个反应管中扩增出多条目的DNA片段，从而实现一次性快速鉴别和诊断多种病原体的目的，能有效地提高检验效率，降低检验成本。然而，由于多重PCR是在同一PCR反应体系里加入了多对引物，同一反应体系中多对引物易发生相互作用，如形成发卡结构，二聚体结构等，引物对和引物量越多，引物之间的相互作用越明显，特别是多重荧光PCR反应还需要加入多种靶基因特异的荧光探针，导致反应体系复杂，稳定性不高，从而影响PCR扩增效率，进而影响了多重PCR的广泛应用。/>[0004]目前已有少数方法或试剂可实现多重PCR法检测多种呼吸道病毒，但仍存在可同时检测病毒种类少、不能直接检测RNA病毒或核酸扩增与结果判断需分步进行等问题。建立便捷有效的一步法多重荧光PCR的多种呼吸道病毒联合检测技术，对临床及时有效地鉴别呼吸道病毒感染及应对治疗有极大帮助。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种多重呼吸道病毒联合检测试剂盒及其应用，该试剂盒更快速、准确、且覆盖的病毒种类广泛，能够极大缩短检测时间，有效降低检测成本，弥补了现有呼吸道病毒多重联检技术的不足，为临床呼吸道感染的流行病学调查、预防及诊疗提供了便捷手段。
[0006]本专利技术提供了一种多重呼吸道病毒联合检测试剂盒，包括核酸扩增反应液、A反应液、B反应液、C反应液、D反应液、临界阳性质控品、强阳性对照和阴性对照；其中，所述A反应液包括冠状病毒229E基因、腺病毒基因、副流感病毒2型基因与副流感病毒3型基因的引物及探针溶液；所述B反应液包括流感病毒A型基因、呼吸道合胞病毒A型基因、呼吸道合胞病毒B型基因与人鼻病毒基因的引物及探针溶液；所述C反应液包括流感病毒B型基因、人博卡病毒基因、肠道病毒基因与副流感病毒4型基因的引物及探针溶液；所述D反应液包括人偏
肺病毒基因、冠状病毒OC43基因、副流感病毒1型基因与内参IC基因的引物及探针溶液。
[0007]所述核酸扩增反应液包括：PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、重组M
‑
MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、热敏Uracil
‑
N
‑
Glycosylase酶、抗体结合型热启动Tth DNA polymerase、BSA、DMSO、Mg
2+
中的一种或几种。
[0008]所述A反应液中冠状病毒229E基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.1
‑
3所示；所述腺病毒基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.4
‑
6所示；所述副流感病毒2型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.7
‑
9所示；所述副流感病毒3型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.10
‑
12所示。
[0009]所述B反应液中流感病毒A型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.13
‑
15所示；所述呼吸道合胞病毒A型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.16
‑
18所示；所述呼吸道合胞病毒B型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.19
‑
21所示；所述人鼻病毒基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.22
‑
24所示。
[0010]所述C反应液中流感病毒B型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.25
‑
27所示；所述人博卡病毒基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.28
‑
30所示；所述肠道病毒基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.31
‑
33所示；所述副流感病毒4型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.34
‑
36所示。
[0011]所述D反应液中人偏肺病毒基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.37
‑
39所示；所述冠状病毒OC43基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.40
‑
42所示；所述副流感病毒1型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.43
‑
45所示；所述内参IC基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.46
‑
48所示。
[0012]所述探针序列的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团；其中，所述荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、Cy3、Cy5、Cy7、ROX、RED610、Texas Red、RED670、NED中的一种；所述淬灭基团为6
‑
TAMRA、BHQ
‑
1～3与结合分子沟的非荧光淬灭剂中的一种。
[0013]所述临界阳性质控品和强阳性对照通过扩增的基因片段组合序列Seq No.49构建质粒并导入到大肠杆菌E.coli TOP10菌株，使用NanoDrop
TM One超微量紫外
‑
可见光分光光度计定量，并进行相应倍数稀释而成；所述临界阳性质控品浓度为500
‑
1000copies/ml；所述强阳性对照浓度为1
×
108copies/ml。
[0014]所述阴性对照为无菌生理盐水。
[0015]所述A反应液、B反应液、C反应液与D反应液当中各探针分别标记不同激发波长与发射波长的荧光。
[0016]本专利技术还提供了一种多重呼吸道病毒联合检测试剂盒的应用，包括如下步骤：
[0017]1)将样品加入到采样液中，保存，使用时提取具有样本的采样液中核酸样本；
[0018]2)将核酸样本加入到核酸扩增反应液中，随后分别将其加入到含有A反应液、B反应液、C反应液与D反应液的PCR反应管；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重呼吸道病毒联合检测试剂盒，其特征在于：包括核酸扩增反应液、A反应液、B反应液、C反应液、D反应液、临界阳性质控品、强阳性对照和阴性对照；其中，所述A反应液包括冠状病毒229E基因、腺病毒基因、副流感病毒2型基因与副流感病毒3型基因的引物及探针溶液；所述B反应液包括流感病毒A型基因、呼吸道合胞病毒A型基因、呼吸道合胞病毒B型基因与人鼻病毒基因的引物及探针溶液；所述C反应液包括流感病毒B型基因、人博卡病毒基因、肠道病毒基因与副流感病毒4型基因的引物及探针溶液；所述D反应液包括人偏肺病毒基因、冠状病毒OC43基因、副流感病毒1型基因与内参IC基因的引物及探针溶液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸扩增反应液包括：PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、重组M
‑
MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、热敏Uracil
‑
N
‑
Glycosylase酶、抗体结合型热启动Tth DNA polymerase、BSA、DMSO、Mg
2+
中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述A反应液中冠状病毒229E基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.1
‑
3所示；所述腺病毒基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.4
‑
6所示；所述副流感病毒2型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.7
‑
9所示；所述副流感病毒3型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.10
‑
12所示。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述B反应液中流感病毒A型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.13
‑
15所示；所述呼吸道合胞病毒A型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.16
‑
18所示；所述呼吸道合胞病毒B型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.19
‑
21所示；所述人鼻病毒基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.22
‑
24所示。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述C反应液中流感病毒B型基因的上游引物、探针序列、下游引物如SEQ NO.25
‑
27所示；所述人博卡病毒基因的上游引物、探针序列、下...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵冉，陈颖玮，王雪亮，
申请(专利权)人：上海市临床检验中心，
类型：发明
国别省市：