基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法，具体方法为：提取儿童感染后的微量样本DNA，并对所述DNA进行浓度测定和质量控制；建立样本DNA的测序文库，之后进行高通量测序并筛选；与参考数据库进行比对，得到比对比例在70％以上且没有多重比对的序列，之后进行致病微生物的筛选，即完成了所述检测和鉴定方法。本发明专利技术所述方法针对儿童微量样本优化了DNA抽提以及建库方法，提高微量样本建库成功率和测序有效数据量；建立了致病微生物筛选鉴定策略，有效排除实验室和试剂污染，并能够有效完成致病微生物的鉴定。

【技术实现步骤摘要】
基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法
本专利技术属于微生物检测
，具体涉及基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法。
技术介绍
感染性疾病是儿童最常见的疾病之一，为儿科临床关注的重点。儿童感染临床表现不典型，多为非特异性表现，很难通过临床表现进行早期识别。快速准确地查明感染病原的基础上，选择合理的治疗方案，可以有效控制疾病的发生发展。因此，做好儿童感染性疾病的早期诊断、早期治疗对降低儿童死亡率有重要意义。传统的病原检测方法包括涂片镜检，免疫学检测，微生物培养，分子检测。然而这些方法每次只能检测到一种或有限的病原体，此外培养还存在阳性率低的缺点，特别是国内抗生素应用较为广泛，血培养阳性率仅为10％，脑脊液培养阳性率更低；另外病原学培养需要时间较长，至少需要3天；对生长速度慢以及培养条件苛刻的细菌检出率更低(例如结核分枝杆菌长达一个月)；而对病毒的免疫学检测存在窗口期；分子检测需要提前确定检测范围，针对性的选择特异的引物或者探针检测某些病原体。目前常用的辅助诊断方法包括血常规及其分类、急性相反应蛋白如C反应蛋白和降钙素原等，特异性和敏感性均较差。宏基因组测序(mNGS)是指对特定环境下的微生物群体基因组进行测序的技术。由于mNGS避免了传统方法中绝大部分微生物不能培养的缺陷，对于临床病原微生物的诊断具有重要意义。此外该技术还具有检测周期短(1-2天)，检测范围广，结果丰富(菌种鉴定，耐药检测)等特点。目前该技术已被广泛的应用于中枢、呼吸道、败血症感染的病原微生物诊断中。Charles等在2014年报道的案例中，一例免疫缺陷病人多达38项传统病原微生物检测方法阴性，最后进展为癫痫和脑积水，而利用mNGS在脑脊液中检测出475条钩端螺旋体的序列，并迅速改变用药策略，最终在mNGS诊断25天后治愈。作为第一例证明mNGS可以提供有效的临床信息的案例，迅速开启了mNGS在临床中的应用。有研究表明mNGS相比于培养等方法，mNGS敏感性达到93.7％，阳性率提高了2.7倍。然而，目前mNGS主要应用于成人感染性疾病的检测，在儿童中的应用较少。由于儿童样本较难获取，并且样本量较少(例如脑脊液通常少于1ml，血液1-2ml)的特点，为核酸提取以及mNGS的文库构建提出了挑战。此外，由于mNGS是对所有微生物群体的基因组的测序，实验室或试剂等背景污染以及人体不同部位定植菌群的存在使得mNGS的检出结果通常较为复杂。因此，对于mNGS结果的解读，即如何区分背景污染，以及如何从定植菌群中识别真实的致病菌是mNGS应用的关键。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法，针对儿童微量样本建立高效的核酸提取以及对应的文库构建方法，开发从背景以及定植微生物中筛选致病菌的策略，从而建立基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原体检测和鉴定方法。该方法的建立对于快速明确儿童感染性疾病的病原，从而制定针对性的治疗策略，降低患儿住院时间、医疗费用、抗生素使用天数以及死亡率具有重要意义。本专利技术所采用的技术方案为：基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法，包括如下步骤：(1)将采集的待测样本进行处理，得到处理后样本；(2)提取所述处理后样本的DNA，并对所得DNA进行浓度测定和质量控制，得到样本DNA；(3)构建所述样本DNA的测序文库，得到样本测序文库；(4)对所述样本测序文库进行高通量测序，之后对测序数据进行筛选，得到处理后样本序列；(5)将所述处理后样本序列与参考数据库进行比对，得到比对比例在70％以上且没有多重比对的序列，之后进行致病微生物的筛选，即完成所述基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法。进一步的，步骤(1)中，所述待测样本处理方法具体为：当所述待测样本为脑脊液、肺泡灌洗液、腹水体液类待测样本中的一种时，需取1-2ml待测样本20000G(G为离心机的国际单位,转速r/min变为g的公式：RCF＝1.12*10^(-5)*r*(r/min)^2)离心5min，弃上清，得到所述处理后样本；当所述待测样本为全血样本时需分离血浆，取1-2ml全血在1600G、4℃下离心10min，分离血浆勿触动白膜层，随后16000G、4℃下离心10min吸取上清作为处理后样本；当所述待测样本为咽拭子样本时，需要震荡挤压，首先加入1-2mL无菌PBS浸泡咽拭子5-10min，且每隔1-2min震荡30s，充分挤压咽拭子棉棒获得洗脱液，之后吸取1-2mL洗脱液作为处理后样本；当所述待测样本为导管样本时，需要剪碎后震荡，首先将导管样本剪碎，加入1-2mL无菌PBS浸泡5-10min，且每隔1-2min震荡30s，充分震荡混匀后吸取1-2mL浸泡液作为处理后样本。进一步的，步骤(2)中，提取全血样本来源的处理后样本DNA，使用的为MagMAX游离DNA分离试剂盒；提取脑脊液、处理后肺泡灌洗液、处理后腹水体液类样本来源的处理后样本DNA，以及咽拭子样本来源的处理后样本和导管样本来源的处理后样本DNA使用的为凯杰UCP病原体小试剂盒；所述浓度测定使用的为Qubit荧光定量仪进行测定，所述质量控制为利用电泳对所得DNA进行质量控制。进一步的，步骤(3)中，所述构建样本DNA测序文库使用的为KAPADNA文库制备试剂盒。进一步的，由全血样本得到的样本DNA构建测序文库的步骤包括末端修复、加Adapter连接、纯化、扩增、纯化；由脑脊液、肺泡灌洗液、腹水等体液类样本得到的样本DNA，咽拭子样本和导管样本得到的样本DNA构建测序文库的步骤包括DNA打断、末端修复、加Adapter连接、片段选择、纯化、扩增、纯化。进一步的，样本DNA总量＞60ng时，构建测序文库所需起始DNA总量为50-100ng；60ng＞样本DNA总量＞25ng时，构建测序文库所需起始DNA总量为20-30ng；25ng＞样本DNA总量＞15ng时，构建测序文库所需起始DNA总量为10ng；样本DNA总量＜15ng时，构建测序文库所需起始DNA总量为30ul；样本DNA总量<<15ng时(<<为远小于，即样本DNA量极低时)，构建测序文库所需起始DNA总量为30ul+10ng内参；构建测序文库所需起始DNA总量≥50ng时，添加Adapter体积为2.5ul；50ng＞构建测序文库所需起始DNA总量＞10ng，添加Adapter体积为1.5ul；10ng≥构建测序文库所需起始DNA总量＞3ng，添加Adapter体积为0.5ul；构建测序文库所需起始DNA总量≤3ng时，添加Adapter体积为0.2ul；对于除全血样本之外的其他样本DNA，基因组DNA＞50ng时，扩增选择PCR循环数为7个循环；50ng≥基因组DNA＞10ng，扩增选择PCR循环数为9个循环；10ng≥基因组DNA时，扩增选择PCR循环数为11个循环；对于全血样本得到的样本DNA，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)将采集的待测样本进行处理，得到处理后样本；/n(2)提取所述处理后样本的DNA，并对所得DNA进行浓度测定和质量控制，得到样本DNA；/n(3)构建所述样本DNA的测序文库，得到样本测序文库；/n(4)对所述样本测序文库进行高通量测序，之后对测序数据进行筛选，得到处理后样本序列；/n(5)将所述处理后样本序列与参考数据库进行比对，得到比对比例在70％以上且没有多重比对的序列，之后进行致病微生物的筛选，即完成所述基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法。/n

【技术特征摘要】
1.基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将采集的待测样本进行处理，得到处理后样本；
(2)提取所述处理后样本的DNA，并对所得DNA进行浓度测定和质量控制，得到样本DNA；
(3)构建所述样本DNA的测序文库，得到样本测序文库；
(4)对所述样本测序文库进行高通量测序，之后对测序数据进行筛选，得到处理后样本序列；
(5)将所述处理后样本序列与参考数据库进行比对，得到比对比例在70％以上且没有多重比对的序列，之后进行致病微生物的筛选，即完成所述基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法。


2.根据权利要求1所述基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待测样本处理方法具体为：
当所述待测样本为脑脊液、肺泡灌洗液、腹水体液类待测样本中的一种时，需取1-2ml待测样本20000G离心5min，弃上清，得到所述处理后样本；当所述待测样本为全血样本时需分离血浆，取1-2ml全血在1600G、4℃下离心10min，分离血浆勿触动白膜层，随后16000G、4℃下离心10min吸取上清作为处理后样本；当所述待测样本为咽拭子样本时，需要震荡挤压，首先加入1-2mL无菌PBS浸泡咽拭子5-10min，且每隔1-2min震荡30s，充分挤压咽拭子棉棒获得洗脱液，之后吸取1-2mL洗脱液作为处理后样本；当所述待测样本为导管样本时，需要剪碎后震荡，首先将导管样本剪碎，加入1-2mL无菌PBS浸泡5-10min，且每隔1-2min震荡30s，充分震荡混匀后吸取1-2mL浸泡液作为处理后样本。


3.根据权利要求1所述基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，提取全血样本来源的处理后样本DNA，使用的为MagMAX游离DNA分离试剂盒；提取脑脊液、肺泡灌洗液、腹水体液类样本来源的处理后样本DNA，以及咽拭子样本来源的处理后样本和导管样本来源的处理后样本DNA使用的为凯杰UCP病原体小试剂盒；
所述浓度测定使用的为Qubit荧光定量仪进行测定，所述质量控制为利用电泳对所得DNA进行质量控制。


4.根据权利要求1所述基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述构建样本DNA测序文库使用的为KAPADNA文库制备试剂盒。


5.根据权利要求4所述基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法，其特征在于，由全血样本得到的样本DNA构建测序文库的步骤包括末端修复、加Adapter连接、纯化、扩增、纯化；由脑脊液、肺泡灌洗液、腹水体液类样本得到的样本DNA，以及咽拭子样本和导管样本得到的样本DNA构建测序文库的步骤包括DNA打断、末端修复、加Adapter连接、片段选择、纯化、扩增、纯化。


6.根据权利要求5所述基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法，其特征在于，样本DNA总量＞60ng时，构建测序文库所需起始DNA总量为50-100ng；60ng＞样本DNA总量＞25ng时，构建测序文库所需起始DNA总量为20-30ng；25ng＞样本DNA总量＞15ng时，构建测序文库所需起始DNA总量为10ng；样本DNA总量＜15ng时，构建测序文库所需起始DNA总量为30ul；样本DNA总量<<15ng时，构建测序文库所需起始DNA总量为30ul+10ng内参；
构建测序文库所需起始DNA总量≥50ng时，添加Adapter体...

【专利技术属性】
技术研发人员：甘明宇，吴冰冰，周文浩，卢宇蓝，王立波，王传清，
申请(专利权)人：复旦大学附属儿科医院，
类型：发明
国别省市：上海;31