一种单链DNA的合成及错误纠正方法技术

本发明专利技术提供一种单链DNA的合成及错误纠正方法，涉及基因合成领域，具体涉及单链DNA的合成及合成中的错误纠正方法。本发明专利技术要能够剔除DNA合成中的错误片段，提高单链DNA合成片段的正确率。本发明专利技术提供一种单链DNA合成的方法，通过在目标序列的两端设计酶切位点和形成发夹结构，通过限制性内切酶和错配特异性内切酶进行错误纠正，得到正确的DNA片段。

Synthesis and error correction of single strand DNA

【技术实现步骤摘要】
一种单链DNA的合成及错误纠正方法
本专利技术涉及基因合成领域，具体涉及一种单链DNA的合成及错误纠正方法。
技术介绍
DNA合成过程中会随机的发生碱基突变、缺失和插入的现象，会影响下游的应用。因此对合成的DNA进行纠错处理，降低其内在的突变率，对提高下游的基因合成和文库构建的质量可以起到关键作用。至目前为止，有很多DNA纠错的方法被开发出来(ErrorCorrectioninGeneSynthesisTechnology,TrendsBiotechnol.2012Mar；30(3):147–154.)，但是这些方法都是对双链DNA进行纠错，并没有对单链DNA进行纠错的方法。随着CRISPR技术的发展，对gRNA文库构建需求越来越大，芯片引物由于其通量高单个引物的价格低廉，成为gRNA文库构建的首选，但芯片引物由于其技术的局限性，在合成过程中其突变率较高，因此开发一种降低引物突变率的基因合成方法是未来研发人员努力的方向。
技术实现思路
为了解决现有技术中单链DNA合成过程中突变率高的问题，本专利技术提供一种新的DNA设计方式，通过此种方式可以对DNA进行错误纠正，提高DNA有效区域的正确率。本专利技术提供一种单链DNA合成的方法，所述方法包含步骤：(1)在目标DNA的3’端连接酶切位点序列，并生成反向互补序列；(2)通过一段辅助序列连接(1)中的两条序列并合成；(3)退火使(2)中序列形成包含发夹结构的双链DNA；(4)加入限制性内切酶切割发夹结构；(5)加入错配特异性内切酶进行错误纠正；其中，所述辅助序列自身能够形成发夹结构；所述错配特异性内切酶是指能够识别并裂解含有因碱基突变、插入或缺失导致的DNA双链中碱基错配的酶。本专利技术的一些实施方案中，所述错误纠正是将由于碱基突变、插入或缺失而导致不完全互补的双链DNA结构进行切割。本专利技术的另一些实施方案中，所述限制性内切酶能够识别双链DNA中的酶切位点并将双链DNA进行酶切产生粘性末端或平末端。本专利技术的一些实施方案中，所述目标DNA包含5-200个碱基；优选5-100；更优选5-60；再优选5-30；最优选10-30。本专利技术的一些实施方案中，所述目标DNA包含的碱基数选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30的任意值。本专利技术的再一些实施方案中，所述辅助序列包含任意数量的碱基；优选4-100；更优选4-20；再优选4-10；最优选4-6。本专利技术的一些实施方案中，所述辅助序列包含碱基数选自4、5、6、7、8、9中的任意值；优选4、5、6；更优选4、6；最优选4。本专利技术的一些实施方案中，在错配特异性内切酶进行错误纠正后还包含变性的步骤，通过变性使双链DNA双链打开得到目标单链DNA。本专利技术的另一些实施方案中，在目标DNA序列连接酶切位点序列前还包含在目标DNA序列的两端连接包含8-40个碱基序列的步骤，并在错误纠正步骤完成后，以所述8-40个碱基序列为引物进行PCR得到富集的目标DNA。本专利技术的一些实施方案中，所述限制性内切酶和错配特异性内切酶在不影响彼此发挥作用的前提下，可以同时加入。本专利技术的一些实施方案中，所述的错配特异性内切酶选自但不限于NucleaseS。本专利技术的另一些实施方案中，错误纠正是指将含错配碱基的双链DNA切割，保留正确的DNA双链结构。在本专利技术的又一些实施方案中，限制性内切酶是可以切出平末端的酶，在错配特异性内切酶将含错配碱基的双链DNA切割后，正确的双链DNA被保留，此时通过变性即可得到目标DNA的单链结构。本专利技术的再一些实施方案中，限制性内切酶是可以切出粘性末端的酶，通过设计与目标DNA匹配的引物序列对目标DNA的富集扩增，可以将粘性末端的多余碱基去除。本专利技术的一些实施方案中，当目标DNA序列包含的碱基数很少，又需要通过PCR进行富集时，在序列设计阶段可以在目标DNA的两端连接包含8-40碱基的序列，并将该序列作为引物以完成PCR，获得目标DNA片段的富集。本专利技术的一些实施方案中，将需要合成的单链DNA设计成能够形成发夹的序列，通过缓慢退火，使其自身形成发夹结构；再加入限制性内切酶将发夹结构切割；下一步加错配特异性内切酶将含错配碱基的DNA进行切割；将切割后产物作为模板，加入引物扩增得到目标区域，这里的引物可以在设计目标DNA序列时加入一段引物序列，使双链DNA能够与相应的引物序列结合完成扩增反应。本专利技术的一个实施方案中，包括如下步骤：(1)在目标DNA的3’端加入限制性酶切位点，该序列记为序列A，将A序列进行反向互补得到A’序列；将A与A’序列结合起来，中间用一段辅助序列连接，得到最终需要合成的DNA序列A-辅助序列-A’；(2)将对应的序列通过芯片或者普通引物合成仪进行合成，得到合成混合物，这时正确的片段和错误的片段混合在一起；(3)将合成的DNA混合物进行退火，让单链DNA退火形成自身发夹结构，如果DNA合成中出现碱基突变或者缺失、插入，则形成的发夹结构为不能完全碱基互补配对；如没有碱基的突变、缺失或插入则发卡结构中A和A’形成互补双链，酶切位点也形成双链的互补配对序列；(4)同时加入限制性内切酶和错配特异性内切酶将发夹结构和含错配碱基的双链切割。本专利技术的一些实施方案中，退火得到的产物中，加入限制性内切酶如EcoRI和错配特异性内切酶如NucleaseS，对含错配碱基的双链结构进行切割，加入引物对目标区域进行PCR富集，或者直接对序列进行克隆。加入对应引物，以正确的双链DNA为模板进行PCR扩增，进一步将正确的DNA序列富集，或者直接对序列进行克隆。本专利技术还提供一种单链DNA合成中的错误纠正方法，所述方法包含步骤：(1)在目标DNA的3’端连接酶切位点序列，并生成反向互补序列；(2)通过一段辅助序列连接(1)中的两条序列并合成；(3)退火使(2)中序列形成包含发夹结构的双链DNA；(4)加入限制性内切酶切割发夹结构；(5)加入错配特异性内切酶进行错误纠正；其中，所述辅助序列自身能够形成发夹结构；所述错配特异性内切酶是指能够识别并裂解含有因碱基突变、插入或缺失导致的双链DNA中碱基错配的酶。本专利技术的一些实施方案中，所述错误纠正是将由于碱基突变、插入或缺失而导致不完全互补的双链DNA结构进行切割。本专利技术的另一些实施方案中，所述限制性内切酶能够识别双链DNA中的酶切位点并将双链DNA进行酶切产生粘性末端或平末端。本专利技术的一些实施方案中，所述目标DNA包含5-200个碱基；优选5-100；更优选5-60；再优选5-30；最优选10-30。本专利技术的一些实施方案中，所述目标DNA包含的碱基数选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30的任意值。本专利技术的再一些实施方案中，所述辅助序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单链DNA合成的方法，所述方法包含步骤：(1)在目标DNA的3’端连接酶切位点序列，并生成反向互补序列；(2)通过一段辅助序列连接(1)中的两条序列并合成；(3)退火使(2)中序列形成包含发夹结构的双链DNA；(4)加入限制性内切酶切割发夹结构；(5)加入错配特异性内切酶进行错误纠正；其中，所述辅助序列自身能够形成发夹结构；所述错配特异性内切酶是指能够识别并裂解含有因碱基突变、插入或缺失导致的双链DNA中碱基错配的酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种单链DNA合成的方法，所述方法包含步骤：(1)在目标DNA的3’端连接酶切位点序列，并生成反向互补序列；(2)通过一段辅助序列连接(1)中的两条序列并合成；(3)退火使(2)中序列形成包含发夹结构的双链DNA；(4)加入限制性内切酶切割发夹结构；(5)加入错配特异性内切酶进行错误纠正；其中，所述辅助序列自身能够形成发夹结构；所述错配特异性内切酶是指能够识别并裂解含有因碱基突变、插入或缺失导致的双链DNA中碱基错配的酶。


2.权利要求1所述的方法，所述错误纠正是将由于碱基突变、插入或缺失而导致不完全互补的双链DNA进行切割。


3.权利要求1-2任一项所述的方法，所述限制性内切酶能够识别双链DNA中的酶切位点并将双链DNA进行酶切产生粘性末端或平末端。


4.权利要求1-3任一项所述的方法，所述目标DNA包含5-200个碱基；优选5-100；更优选5-60；再优选5-30；最优选10-30。


5.权利要求1-4任一项所述的方法，所述辅助序列包含任意数量的碱基；优选4-100；更优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：李一凡，邱蔚，吴政宪，
申请(专利权)人：江苏金斯瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32