制备脱氧核糖核苷三磷酸生物合成新方法技术

本发明专利技术涉及人工合成DNA必备原料的制备方法，属于重要化学品的生物合成和生物催化技术领域。采用酶水解和酶催化全新工艺，选用鲐鱼精DNA为原料，用磷酸二酯酶将其水解生成dNMP混合物，经离子交换层析分离提纯后，用活性酵母全细胞催化合成dNTP混合物，然后用制备色谱分离纯制得四种高纯度的单体化合物，再复配成等摩尔的dNTP生化试剂。本工艺反应绿色环保，高效，产品纯度达99.9%以上，成本低，可以工业化生产，极具竞争力。

【技术实现步骤摘要】
制备脱氧核糖核苷三磷酸生物合成新方法
本专利技术涉及一种利用酶水解和酵母催化的全新生物合成方法，底物易得价廉，工艺反应绿色环保、高效，产品纯度达99.9%以上，整个工艺成本低，可以工业化生产，极具竞争力。
技术介绍
dNTP是脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP四个产品，是PCR扩增、DNA测序、分子标记、cDNA合成不可或缺的生化试剂，需求量不断扩大。dNTP试剂要求纯度高，无核酸酶污染，现阶段国内的dNTP试剂原料大多来源于国外，价格昂贵。本项目工艺路线是采用鲐鱼精DNA为原料，用磷酸二酯酶水解生成dNMP（dAMP,dGMP,dTMP,dCMP）混合物，经离子交换层析分离提纯后，用酵母全细胞催化合成dNTP（dATP,dGTP,dTTP,dCTP）混合物，然后用制备色谱分离纯制得四种高纯度的单体化合物，再复配成等摩尔的dNTP生化试剂。本工艺采用的酶法合成工艺，底物价廉易得，反应绿色环保，高效，采用制备色谱分离技术，产品纯度可达99.9%以上，生产成本低，极具竞争力。
技术实现思路
本生物合成新工艺制备脱氧核糖核苷三磷酸的方法包括以下步骤：应用桔青霉发酵生产磷酸二酯酶。从市场上采购桔青霉PenicilliumcitrinumM71菌株,对其进行优化后，得到磷酸二酯酶，其以DNA为底物的酶活大于200u/ml，分泌蛋白量大于1g/L。应用磷酸二酯酶水解鲐鱼精DNA生产四种脱离氧核苷酸混合物（dMTP）。用上述方法制得的磷酸二酯酶水解鲐鱼精DNA，以DNA为底物的浓度为2.0～4.0%，酶解温度55～60℃，pH值6.5～7.0，酶解时间2～4小时，水解率大于99%。经离子交换层析提纯水解后混合物。经离子交换层析分离提纯后，在分离中采用201×8的阴离子交换树脂,其具体条件为：柱床高105mm，柱床直径45mm，样品浓度213mg/mL，洗脱流速0.5mL/(cm~2.min)。去除杂质率达90%以上，得纯化后的dMTP混合液。脱离氧核苷酸转化为脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）能力的活性酵母培育。取酿酒酵母进行活性酵母培育，酵母优反应条件为：dNMP1.40g/L，葡萄糖40.98g/L，MgCl2·6H2O4.00g/L，KCl2.00g/L，NaH2PO431.20g/L，酵母300.00g/L，氯化铵0.67g/L，乙醛11.7mL/L，pH7.0，温度29.6°C。在该条件下，dNTP浓度2.10g/L，得率达到93.7%，产物浓度是优化前0.52g/L的四倍。活性酵母全细胞催化脱氧核苷酸（dNMP）转化为脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）。用制得的活性酵母对纯化后的dNMP混合液进行全细胞催化，转化为dNTP混合物，活性酵母转化反应底物浓度为0.5～1.0g/L，反应温度37℃，pH值6.5～7.0，反应时间8～10小时，各种化合物的转化率均大于70%。高效制备色谱纯化dNTP混合物为单体化合，再复配成等摩尔的dNTP生化试剂。采用高效制备色谱纯化产品，各组分产品纯度可大于99.9%，且工艺简单高，产品纯度高。具体实施方式：应用桔青霉发酵生产磷酸二酯酶技术。以购买的桔青霉P.citrinumST817为出发菌株,经紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)、高温处理和硫酸二乙酯(DES)诱变,获得一株5’-磷酸二酯酶的高产菌株P.citrinumYB-1,摇瓶发酵酶活达到693U/mL,比出发菌株提高了2.5倍,经遗传稳定性实验证实,菌株YB-1产酶性能稳定。采用单因素试验对菌株P.citrinumYB-1的发酵培养基和培养条件进行了优化,确定了最佳发酵培养基组成为(g/L):葡萄糖60;蛋白胨6;KH_2PO_40.4;K_2HP_O40.6;MgSO_4·7H_2O0.3;CaCl_20.2;MnSO_40.15;确定的较优培养条件为:初始pH5.5,培养温度30℃,摇瓶装液量35mL/250mL三角瓶,摇床转速180r/min,发酵时间72h。应用磷酸二酯酶水解鲐鱼精DNA生产脱离氧核苷酸混合物（dMTP）技术。用上述方法制得的磷酸二酯酶水解鲐鱼精DNA，以DNA为底物的浓度为2.0～4.0%，酶解温度55～60℃，pH值6.5～7.0，酶解时间2～4小时，水解率大于99%。水解后混合物经离子交换层析分离提纯后，在分离中采用201×8的阴离子交换树脂,其具体条件为：柱床高105mm，柱床直径45mm，样品浓度213mg/mL，洗脱流速0.5mL/(cm~2.min)。去除杂质率达90%以上，得纯化后的dMTP混合液。具有全细胞催化dNMP转化为dNTP能力的活性酵母培育技术。取酿酒酵母进行活性酵母优化培育，酵母优反应条件为：dAMP1.40g/L，葡萄糖40.98g/L，MgCl2·6H2O4.00g/L，KCl2.00g/L，NaH2PO431.20g/L，酵母300.00g/L，氯化铵0.67g/L，乙醛11.7mL/L，pH7.0，温度29.6°C。在该条件下，dATP浓度2.10g/L，得率达到93.7%，产物浓度是优化前0.52g/L的四倍。得到优化后的酵母催化原液。活性酵母全细胞催化dNMP转化为dNTP技术。用制得的活性酵母对纯化后的dNMP混合液进行全细胞催化，转化为dNTP混合物，活性酵母转化反应底物浓度为0.5～1.0g/L，反应温度37℃，pH值6.5～7.0，反应时间8～10小时，各种化合物的转化率均大于70%。高效制备色谱纯化dNTP混合物为单体化合物。使用新型仪器高效制备色谱纯化dNTP混合物为单体化合物各组分产品纯度大于99.9%，工艺简单，产品纯度高。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备脱氧核糖核苷三磷酸生物合成新方法，本专利技术是通过以下过程和方法实现的：/n（1）选取鲐鱼精DNA作为基础原料，经过多次试验，发现鲐鱼精DNA易得价廉，且用磷酸二酯酶水解的水解率达到99%以上。降低了整个工艺的成本;/n（2）磷酸二酯酶酶水解，应用桔青霉发酵生产的磷酸二酯酶，水解鲐鱼精DNA生产四种脱离氧核苷酸混合物（dNMP）后，经离子交换层析分离提纯。用桔青霉桔青霉发酵生产磷酸二酯酶, 酶活大于200u/ml，分泌蛋白量大于1g/L，用磷酸二酯酶水解鲐鱼精DNA，以DNA为底物的浓度为2.0～4.0%，酶解温度55～60℃，pH值6.5～7.0，酶解时间2～4小时，水解率大于99%，水解后混合物经离子交换层析分离提纯后，去除杂质率达90%以上，以备下一步酶催化使用;/n（3）活性酵母全细胞催化，活性酵母全细胞催化脱离氧核苷酸混合物（dNMP）转化为/n脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，利用活性酵母可一次性将四种一磷酸化合物转化为三磷酸化合物，各种化合物的转化率均大于70%，不断筛选得到优质菌株酵母。然后将活性酵母用于全细胞催化dNMP，转化反应底物浓度为0.5～1.0g/L，反应温度37℃，pH值6.5～7.0，反应时间8～10小时，各种化合物的转化率均大于70%;/n （4）纯化复配，高效制备色谱纯化dNTP混合物为单体化合物，再复配成等摩尔的dNTP生化试剂，采用高效制备色谱纯化产品，工艺简单，且各组分产品纯度大于99.9%，再复配成等摩尔的dNTP生化试剂。/n...

【技术特征摘要】
1.制备脱氧核糖核苷三磷酸生物合成新方法，本发明是通过以下过程和方法实现的：
（1）选取鲐鱼精DNA作为基础原料，经过多次试验，发现鲐鱼精DNA易得价廉，且用磷酸二酯酶水解的水解率达到99%以上。降低了整个工艺的成本;
（2）磷酸二酯酶酶水解，应用桔青霉发酵生产的磷酸二酯酶，水解鲐鱼精DNA生产四种脱离氧核苷酸混合物（dNMP）后，经离子交换层析分离提纯。用桔青霉桔青霉发酵生产磷酸二酯酶,酶活大于200u/ml，分泌蛋白量大于1g/L，用磷酸二酯酶水解鲐鱼精DNA，以DNA为底物的浓度为2.0～4.0%，酶解温度55～60℃，pH值6.5～7.0，酶解时间2～4小时，水解率大于99%，水解后混合物经离子交换层析分离提纯后，去除杂质率达90%以上，以备下一步酶催化使用;
（3）活性酵母全细胞催化，活性酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：张天时，张先文，
申请(专利权)人：南京曼蕊生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32