使用基于水凝胶的液滴进行单细胞基因组测序制造技术

技术编号:22569543 阅读:54 留言:0更新日期:2019-11-17 10:01
本公开提供了超高通量的单细胞基因组测序方法,在本文中称为“SiC‑seq”,所述方法包括将单细胞包封在熔融凝胶液滴中以促进微凝胶中的大量细胞裂解和基因组DNA的纯化。还提供了用于实践本发明专利技术方法的系统和装置。

Single cell genome sequencing using droplets based on hydrogel

The present disclosure provides an ultra high throughput single cell genomic sequencing method in this paper called \SiC SEQ\, which includes encapsulating single cells in molten gel droplets to facilitate a large number of cell lysis and purification of genomic DNA in microgels. A system and apparatus for practicing the method of the invention are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用基于水凝胶的液滴进行单细胞基因组测序交叉引用本申请要求2016年12月21日提交的美国临时专利申请第62/437,605号的权益,其以全文引用的方式并入本文中。政府支持本专利技术是在政府支持下在由美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的授权号AR068129、R01EB019453和R21HG007233下;由美国国家科学基金会(NationalScienceFoundation)授予的授权号1253293下;由国防部高级研究计划局(DepartmentofDefense,DefenseAdvancedResearchProjectsAgency)授予的授权号HR0011-12-C-0065下;以及由空间和海战系统中心(SpaceandNavalWarfareSystemsCenter)授予的授权号N66001-12-C-4211下制成的。政府拥有本专利技术的某些权利。
技术介绍
将单细胞测序施加于异质系统时常见的挑战是其通常含有大量细胞:厘米大小的肿瘤可能含有亿万个突变的癌细胞,而一毫升的海水可能含有数百万个微生物。此外,每个细胞都具有少量的DNA,因此难以准确地扩增和测序如此多单细胞。基于光学镊子、流式细胞术、微流体、凝胶包封和虚拟微流体的方法可以分离和处理数百个单细胞用于测序,但这构成大多数群落的一小部分。取样的稀疏性限制了可以解决的问题,大多数研究结果与最丰富的亚种群有关。例如,常见的环境群落含有>1500个分类群,稀有分类群以<0.1%存在,其中大多数是单细胞测序错过的;事实上,捕获这些细胞的难度是“微生物暗物质”的基础-人们认为存在大量物种,但这种物质从未被表征过。因此,一种可以显著增加通过单细胞测序而测序的细胞数量的方法将影响生物学中广泛的问题,其中异质性是重要的。
技术实现思路
本公开提供了超高通量的单细胞基因组测序方法,在本文中称为“SiC-seq”,所述方法包括在熔融凝胶液滴中包封单细胞以促进微凝胶中的大量细胞裂解和基因组DNA的纯化。还提供了用于实践本专利技术方法的系统和装置。附图说明当结合附图阅读时,从以下详细描述中可最佳地理解本专利技术。附图中包括以下图:图1提供了根据本公开的一个实施例的微流体装置的示意图,其用于a)产生条形码液滴并将细胞包封在微凝胶中;b)用标记试剂重新包封凝胶;和c)将凝胶液滴与条形码液滴和PCR液滴合并。图2提供了根据本公开的一个实施例的实例SiC-seq工作流程的示意图。将单细胞包封在微凝胶中,并将基因组纯化并片段化,例如,在一系列清洁剂和酶洗涤中。然后用核酸标记基因组片段,所述核酸例如DNA,每个液滴独有的条形码序列。合并得到的条形码基因组片段并测序,产生可以基于共享条形码由单细胞分组的读段。读段组包含单细胞的低覆盖度基因组的数据库,其可以例如使用计算机模拟血细胞计数进行分析。图3A-3C提供了根据本公开的一个实施例的以产生SiC-seq库的微流体和生物化学工作流程的示意图。图3A)通过使用流动聚焦液滴制造器用PCR试剂包封有限稀释下的随机DNA寡核苷酸来产生条形码液滴。对液滴进行热循环,产生含有每约9个空液滴的独特条形码序列的克隆群体的液滴(SYBR染色用于可视化)。图3B)用熔融凝胶(例如熔融琼脂糖)在有限稀释下包封细胞,例如细菌,以产生含有微凝胶的单细胞,例如含有琼脂糖微凝胶的单细胞。通过一系列大量洗涤(例如清洁剂和酶洗涤)纯化单细胞基因组。然后将纯化的单细胞基因组重新包封并标记,例如标记(tagmented)。图3C)将标记的,例如标记的,含基因组的微凝胶与含有条形码和核酸扩增试剂(例如PCR试剂)的液滴合并。在热循环期间,条形码剪接到标记的,例如标记的基因组片段上,产生嵌合分子,所述嵌合分子由附接到易于大规模平行测序的细胞基因组的随机片段的条形码组成。图4描绘了显微镜图像和表征琼脂糖微凝胶内基因组片段扩散的图。a)SYBR染色用于监测标记之前和之后微凝胶中的基因组的扩散。b)在室温下两天后,通过离心沉淀微凝胶,并从微凝胶和上清液中萃取DNA,并使用QubitdsDNA高灵敏度测定和生物分析仪高灵敏度DNA芯片定量。由于所用的转座酶与基因组的化学计量比相对较低,片段大小的变化相对较小。c)使包封的基因组与转座酶与基因组的更高的化学计量比反应,并在生物分析仪高灵敏度芯片上显现,以显示凝胶包封的基因组的片段化效率。图5A-5E描绘了显示在人工构建的微生物群落上SiC-seq的性能的图。图5A)每个条形码组中的读段分布。图5B)每个条形码组的纯度的直方图,其定义为映射到所述组的最映射物种的读段分数。图5C)对于每个物种使用从左到右计算每个物种的相对丰度估计:使用Bowtie2(Bowtie2读段)分类的读段、使用Bowtie2(Bowtie2条形码)分类的条形码,和使用Kraken(Kraken读段)分类的读段。图5D)对于每种微生物从所有条形码组聚集的读段的相对覆盖度分布。图5E)由相对覆盖度分组的覆盖度直方图。参见用于其它物种的覆盖图6A和6B。图6A和6B描绘了从已知微生物的混合群落测序获得的SiC-seq读段的分布。图6A)用于10kb箱的SiC-seq验证数据集中的枯草芽孢杆菌(Baccilussubtilis)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)参考基因组的聚集覆盖度。图6B)映射具有>2000个读段的随机选择的条形码葡萄球菌(Staphylococcus)组的读段的位置。图7描绘了说明SiC-读段数据库的实例框架的示意图。含有如序列、读段ID和分类特性的读段存储在条形码组中,所述条形码组含有如纯度和分类的特性。所示的序列仅用于举例而非限制。图8说明了用于显示如本文实例中所述的计算机模拟血细胞计数的海洋微生物群落。a)按条形码组的SiC-读段数据库的分类丰度。b)在属水平下的数据库中条形码组的纯度的分布。图9A-9C示出了对回收自旧金山海岸线的海洋群落的SiC-seq的应用。图9A)根据宿主微生物属的抗生素抗性(AR)基因的分布。使用计算机模拟血细胞计数,推导出AR基因与分类学分类的关联。连接线的不透明度反映了数据库中检测到的交互次数。图9B)在群落中检测到的每个属中的毒力因子的相对丰度。毒力比是由毒力因子观察到的条形码组数与所述物种的总条形码组数之间的比率,归一化为0至1的标度。图9C)作为热图绘制的群落中细菌分类群之间转导的相对潜力。图10描绘了通过模拟分离的菌株的基因组序列的读段而获得的参考数据,用于与本文实例中描述的海洋微生物群落中的数据进行比较。a)公共数据库中全基因组测序菌株的抗生素抗性网络。b)针对公开可用菌株计算的毒力因子比。图11描绘了显示每个条形码组的基因组覆盖度的平均值和分布的图,其绘制为每个物种的洛伦兹曲线。图12描绘了显示10细胞对照实验中条形码组的基因组大小-归一化纯度得分的图。使用相同方法使用针对每个相应物种测序的基因组分数而不是原始读段来计算本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种对单细胞基因组DNA进行测序的方法,所述方法包含:/n将单细胞群体包封在熔融凝胶液滴中以提供熔融凝胶液滴群体,其中所述群体的每个熔融凝胶液滴含有零个或一个细胞;/n固化所述熔融凝胶液滴群体以提供固化的微凝胶液滴群体;/n破坏所述固化的微凝胶液滴的乳液以提供固化的微凝胶群体;/n将大量所述固化的微凝胶群体暴露于足以裂解含于所述固化的微凝胶群体内的细胞的裂解条件;/n从含于大量所述固化的微凝胶群体内的细胞纯化基因组DNA,以提供包含纯化的基因组DNA的固化的微凝胶群体;/n将包含纯化的基因组DNA的所述固化的微凝胶群体包封到液滴中,以提供含有纯化的基因组DNA的液滴群体;/n将所述含有纯化的基因组DNA的液滴群体内的所述纯化的基因组DNA片段化,以提供含有片段化的基因组DNA的液滴群体;/n对所述含有片段化的基因组DNA的液滴群体中的所述片段化的基因组DNA或其扩增产物进行条形码化,以提供含有条形码化的片段化的基因组DNA的液滴群体;/n从所述含有条形码化的片段化的基因组DNA的液滴纯化条形码化的片段化的基因组DNA,以提供纯化的条形码化的片段化的基因组DNA;以及/n对所述纯化的条形码化的片段化的基因组DNA进行测序。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20161221 US 62/437,6051.一种对单细胞基因组DNA进行测序的方法,所述方法包含:
将单细胞群体包封在熔融凝胶液滴中以提供熔融凝胶液滴群体,其中所述群体的每个熔融凝胶液滴含有零个或一个细胞;
固化所述熔融凝胶液滴群体以提供固化的微凝胶液滴群体;
破坏所述固化的微凝胶液滴的乳液以提供固化的微凝胶群体;
将大量所述固化的微凝胶群体暴露于足以裂解含于所述固化的微凝胶群体内的细胞的裂解条件;
从含于大量所述固化的微凝胶群体内的细胞纯化基因组DNA,以提供包含纯化的基因组DNA的固化的微凝胶群体;
将包含纯化的基因组DNA的所述固化的微凝胶群体包封到液滴中,以提供含有纯化的基因组DNA的液滴群体;
将所述含有纯化的基因组DNA的液滴群体内的所述纯化的基因组DNA片段化,以提供含有片段化的基因组DNA的液滴群体;
对所述含有片段化的基因组DNA的液滴群体中的所述片段化的基因组DNA或其扩增产物进行条形码化,以提供含有条形码化的片段化的基因组DNA的液滴群体;
从所述含有条形码化的片段化的基因组DNA的液滴纯化条形码化的片段化的基因组DNA,以提供纯化的条形码化的片段化的基因组DNA;以及
对所述纯化的条形码化的片段化的基因组DNA进行测序。


2.根据权利要求1所述的方法,其中所述条形码化包含将每个所述含有片段化的基因组DNA的液滴与含有条形码的液滴合并。


3.根据权利要求2所述的方法,其中每个所述含有条形码的液滴包含独特的核酸条形码序列。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述方法包含将衔接子核酸序列并入所述片段化的基因组DNA。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述单细胞群体包含真核细胞。


6.根据权利要求5所述的方法,其中所述单细胞群体包含哺乳动物细胞。


7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述单细胞群体包含细菌细胞。


8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述单细胞群体包含真菌细胞。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述熔融凝胶液滴包含水凝胶聚合物。


10.根据权利要求9所述的方法,其中所述水凝胶聚合物包含热响应性聚合物。


11.根据权利要求10所述的方法,其中所述热响应性聚合物是琼脂糖。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述固化包含冷却所述熔融凝胶液滴群体。


13.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述熔融凝胶液滴包含聚乙二醇(PEG)。


14.根据权利要求13所述的方法,其中所述固化包含使所述PEG化学交联。


15.根据权利要求13所述的方法,其中所述固化包含使所述PEG光交联。


16.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述熔融凝胶液滴包含丙烯酰胺。


17.根据权利要求16所述的方法,其中所述固化包含使所述丙烯酰胺化学交联。


18.根据权利要求16所述的方法,其中所述固化包含使所述丙烯酰胺光交联。


19.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述熔融凝胶液滴包含藻酸盐。


20.根据权利要求19所述的方法,其中所述固化包含向所述熔融凝胶液滴中添加钙。


21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,其中所述固化的微凝胶包含大小设定成将基因组DNA保留在所述固化的微凝胶内的孔。


22....

【专利技术属性】
技术研发人员:F·兰B·德玛利I·克拉克A·R·阿贝特
申请(专利权)人:加利福尼亚大学董事会
类型:发明
国别省市:美国;US

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