一种提高重组蛋白在CHO细胞中表达水平的方法技术

一种提高重组蛋白在CHO细胞中表达水平的方法，涉及生物医药技术领域，通过在细胞培养基中添加当归提取物来提高重组蛋白在CHO细胞中的表达水平，还可以同时添加其他药材提取物获得更优化的表达水平；本发明专利技术的有益效果是，能通过提高重组蛋白在的表达水平从而提高生产效率，降低生物制品生产工艺对生物反应器规模的需求和细胞培养基的消耗，最终降低生物制品的生产成本。

A method to improve the expression level of recombinant protein in CHO cells

【技术实现步骤摘要】
一种提高重组蛋白在CHO细胞中表达水平的方法
本专利技术涉及生物医药
，更具体地，本专利技术公开了一种提高重组蛋白在CHO细胞中表达水平的方法。
技术介绍
CHO(ChineseHamsterOvary)细胞是由Puck于1957年建成的中国仓鼠卵巢成纤维细胞系，发展至今，CHO细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统。随着无血清悬浮培养技术、基因工程技术、生物反应器设计放大与强化技术、大规模高密度流加和连续灌注培养技术等的发展，CHO细胞系统被广泛应用于抗体、基因重组蛋白质药物、病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产中。CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系，因为它具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子，目前上市的抗体药物中60％以上采用CHO细胞表达。生物技术产品在医药领域得到广泛应用，仅抗体药物的全球年销售额就超过了1000亿美元，单药销售冠军阿达木单抗年销售额超过100亿美元。CHO细胞的表达(发酵)效率是生产成本的主要决定因素，高表达水平能显著缩小对生物反应器规模的需求、降低培养基消耗量，并且能提高纯化的效率、降低纯化成本，因此提高CHO细胞的蛋白表达水平对生物医药行业具有重要的意义。提高CHO细胞的蛋白表达水平通常所采用的措施包括改良表达系统(表达载体、细胞株)、筛选高表达细胞株、优化培养基配方(氨基酸、碳源、维生素、生长因子等)、优化培养条件参数(温度、搅拌、溶氧、pH)等。虽然针对特定的目的蛋白而言，在CHO细胞中的基础表达水平主要由蛋白自身的性质和表达系统决定，但是通过优化培养基配方和培养条件，可将蛋白表达水平大幅提高，有时可提高数倍。当归、女贞子、菟丝子都是我国传统中药。中药提取物是采用规范化的生产工艺对中药生药的化学成分进行提取、加工而得到的具有相对明确药效的物质，是中药市场上一种新的产品形态。其中生药是来源于天然的、未经加工或只经简单加工的植物、动物和矿物类中药材。常用的中药提取方法有煎煮法、回流法、浸渍法、渗漉法等，采用的萃取剂有水、有机试剂(如乙醇)、碱性溶液(如含有碳酸钠的溶液)、酸性溶液(如含有醋酸的溶液)等。采用不同的萃取剂和不同的提取、加工工艺所获得的中药提取物在成分和功效上会有所不同。中药提取物现在已经广泛用于医药、保健、美容、饲料添加剂等领域。
技术实现思路
为提高重组蛋白在CHO细胞中的表达水平，本专利技术提供了一种新的方法，技术方案如下：一种提高重组蛋白在CHO细胞中表达水平的方法，是在细胞培养基中添加当归提取物；优选的，所述的当归提取物是从当归药材中采用20％至30％乙醇提取，并在后面的工艺中去除乙醇。优选的，在细胞培养基中还进一步添加熟地黄提取物；优选的，是熟地黄药材的水提取物。优选的，在细胞培养基中还进一步添加阿胶降解液；优选的，所述的阿胶降解液是将阿胶药材采用盐酸、胃蛋白酶和胰蛋白酶降解制备的。优选的，在细胞培养基中添加的当归提取物终浓度为每升培养基中含有从0.6克～1.2克当归生药中所提取的物质，优选的，是0.9克。优选的，在细胞培养基中添加的熟地黄提取物终浓度为每升培养基中含有从0.4～1.2克熟地黄药材中所提取的物质，优选的，是0.8克。优选的，在细胞培养基中添加的阿胶降解液终浓度为每升培养基中含有从0.1～0.3克阿胶药材中所降解提取的物质，优选的，是0.2克。优选的，所述的细胞是CHO-K1细胞(ATCC编号CRL-9618)或CHO/dhFr-细胞(ATCC编号CRL-9096)。优选的，所述的细胞是表达重组抗EGFR全人源单克隆抗体前药的CHO-K1细胞。优选的，所述的细胞是表达重组抗CD20全人源单克隆抗体的CHO-K1细胞。优选的，所述的细胞是表达重组抗PD-1全人源单克隆抗体的CHO-K1细胞。优选的，所述的细胞是表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的CHO-K1细胞。优选的，所述的细胞是表达重组靶向CD47/PD-L1的双功能融合蛋白的CHO/dhFr-细胞。本专利技术的有益效果是，能大幅提高重组蛋白在CHO细胞中的表达水平，从而降低生物制品生产工艺对生物反应器规模的需求和细胞培养基的消耗，提高生产效率，最终降低生物制品的生产成本。具体实施方式实施例1、当归提取物的制备取当归生药(四川岷县生产)100克，研磨成粉末，用25％乙醇进行两次加热回流提取，每次加入500毫升的乙醇溶液，每次回流1.5小时，每次提取后收集500mL提取液，混合2次提取液，减压抽滤，将滤液减压蒸馏去除乙醇，加蒸馏水至体积为1升，配制成每升溶液含有100克生药的提取物的浓度，用0.45微米孔径滤膜过滤。实施例2、熟地黄提取物的制备取蒸熟地黄药材(怀庆地黄经过九蒸九晒传统工艺加工制成)100克，破碎、研磨成粉末，加入600毫升纯水，加热，沸腾1小时，过滤收集提取液；剩余的药渣再加入400毫升纯水，加热，沸腾1小时，过滤收集提取液。合并2次提取液，加蒸馏水至体积为1升，配制成每升溶液含有100克生药的提取物的浓度，用0.45微米孔径滤膜过滤。实施例3、阿胶降解液的制备将阿胶块(山东东阿阿胶股份有限公司)破碎成粉，取阿胶粉50克，加1升水溶解，80℃炖化30分钟，冷却至室温，冷藏过夜，4500rpm离心10分钟，上清液脱脂棉滤过，加水补足至1升，得阿胶炖化液；用10％盐酸调节pH至2.0，加入胃蛋白酶106U，40℃保温酶解2小时；加10％氢氧化钠溶液调节pH至7.5，加入胰蛋白酶2×106U，40℃保温酶解2小时，煮沸10分钟；离心取上清液，加蒸馏水至体积为1升，经0.45微米孔径滤膜滤过，得阿胶酶解液。实施例4、重组表达外源蛋白的CHO细胞的构建(1)表达重组抗EGFR全人源单克隆抗体前药的CHO细胞构建方法按照专利申请“一种新型抗表皮生长因子受体抗体、其制备方法及用途”(申请号CN201410724477.4、公开号CN104910275A)的方法，所使用的CHO细胞为CHO-K1细胞(ATCC编号CRL-9618)，所使用的重组蛋白基因编码序列见CN104910275A文献所附序列表中的SEQIDNO：1及SEQIDNO：3。按上述方法构建和筛选获得的高表达细胞株命名为CHO-K1/anti-EGFRpro。(2)表达重组抗CD20全人源单克隆抗体的CHO细胞按照本文序列表SEQIDNO:1、SEQIDNO:2的序列合成重组抗CD20全人源单克隆抗体的轻链编码核酸和重链编码核酸，插入真核表达载体pcDNA3.1，脂质体法转染CHO-K1细胞(ATCC编号CRL-9618)，G418加压筛选，获得一个高表达细胞株。按上述方法构建和筛选获得的高表达细胞株命名为CHO-K1/anti-CD20。(3)表达重组抗PD-1全人源单克隆抗体的CHO细胞构建方法按照本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高重组蛋白在CHO细胞中表达水平的方法，其特征是，在细胞培养基中添加当归提取物。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高重组蛋白在CHO细胞中表达水平的方法，其特征是，在细胞培养基中添加当归提取物。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的当归提取物是从当归药材中采用20%至30%乙醇提取，并在后面的工艺中去除乙醇。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，在细胞培养基中还添加熟地黄药材的水提取物和阿胶降解液，所述的阿胶降解液是将阿胶药材采用盐酸、胃蛋白酶和胰蛋白酶降解制备的。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，在细胞培养基中添加的当归提取物终浓度为每升培养基中含有从0.6克～1.2克当归生药中所提取的物质。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，在细胞培养基中添加的当归提取物终浓度为每升培养基中含有从0.9克当归生药中所提取的物质。


6.根据权利要求3所述的方法，其特征是，在细胞培养基中添加的熟地黄提取物...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴建新，黄卫红，谈珉，
申请(专利权)人：上海百迈博制药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31