规模化合成长链RNA的方法及其定点修饰的方法技术

本发明专利技术公开一种规模化合成长链RNA的方法及其定点修饰的方法，所述规模化合成长链RNA的方法包括：设计RNA短片段和夹板DNA片段；连接；加帽；去夹板DNA片段等步骤。本发明专利技术技术方案通过化学法合成大量RNA短片段和不同的夹板DNA片段，然后通过生物法将不同RNA短片段连接起来以形成目的RNA长链。整个工艺操作简单、生产成本低，产物长链RNA的突变率低，并且单次反应可对多条RNA短片段进行组装，可高通量合成长链RNA，以满足长链RNA的规模化生产。此外，通过在RNA短片段上进行化学修饰，可实现对长链RNA的定点修饰。相较传统RNA化学修饰方法，本方法得到的RNA产物稳定性更高、免疫源性降低、翻译效率明显增强，对于RNA药物在临床上的应用有极其重要的作用。

Methods of large-scale synthesis and site-specific modification of long-chain RNA

【技术实现步骤摘要】
规模化合成长链RNA的方法及其定点修饰的方法
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及规模化合成长链RNA的方法及其定点修饰的方法。
技术介绍
随着生物技术的迅猛发展，siRNA、非编码RNA、RNA适配体、核酶等RNA技术飞速发展，RNA在生物学上越来越受到重视(JohnC等.Chemistry&Biology.2012，19(1)：60-71)，以往的一些合成方法已逐渐不能满足科研试验和药物研发对RNA的需求，越来越多的RNA生物学研究和药物研发中需要用到毫克级甚至克级的高纯度RNA，与此同时对RNA产品的质量也提出了更高的要求(LauraE等.RNA.2010，16(3)：647-653)。目前RNA合成的主要方法是化学合成法，该方法的最大优点是可以规模化合成，但是也存在缺点和技术限制，其一是价格昂贵，其二是现有合成技术水平只能合成短链RNA分子，合成RNA的长度一旦超过170nt左右时，其合成效率大幅降低，副产物序列增多，这不仅加大了下游纯化的难度，还进一步推高了成本(张中华.生命科学.2004,16(4)：231-235)(JunichiYano等.AdvanceinPolymerScience，2012,249:1-48)(赵松子等.西北农业学报.2010，16(5)：47-51)。目前，大多数研究人员往往通过转录合成的方法获得大于40nt左右的RNA，即用T7、T3或SP6RNA聚合酶转录带有其启动子的双链DNA模板以获得长单链RNA(SAMcKenna等.NatureProtocols.2007，2，3270-3277)。一般情况下，通过优化转录条件中的Mg2+、三磷酸核苷酸(rNTP)的浓度，一个拷贝DNA模板能产生几十到数百个拷贝的RNA，因此通过这种方法可以得到较大量的RNA产物。但是由于采用化学合成法的过程中需要对2'-OH进行保护，使得RNA的化学合成比DNA的化学合成更有难度。目前，通过化学合成法合成的RNA的长度不超过170nt，无法满足长链RNA的合成需求(其链长大于1000nt)。采用生物合成RNA的方法具有诸多优点，例如可以进行同位素标记或荧光染料进行标记；转录长度不受限制等，因此其广泛用于核酸结构或生物学研究。然而，转录合成RNA分子也存在一些问题：无法实现稳定的规模化生产。其原因在于由于体外转录合成不同长度的RNA需要RNA聚合酶参与，其在生物反应上会造成一定几率的错配，从而引起RNA序列突变，不利于扩大生产。同时，需要制备大量的质粒并用DNA限制性内切酶切成线性质粒；或需要通过大量的PCR反应获得线性模板，而一些具有稳定二级结构的长链RNA(RNA分子5'端和3'端不完全或完全互补碱基数不少于5个)的DNA转录模板单链也会相应具有稳定二级结构，这导致利用DNA引物PCR扩增转录模板时产生非特异性或突变DNA产物，而这些非目的DNA转录的RNA与目的RNA的生物学功能截然不同，因此无法通过PCR方法获得足够量的正确DNA转录模板。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种规模化合成长链RNA的方法及定点修饰长链RNA的方法，该方法首先利用化学法合成大量RNA短链片段，然后通过生物合成法将RNA短链片段连接成长链RNA，以克服相关技术中无法规模化生产长链RNA的问题。为实现上述目的，本专利技术提出一种规模化合成长链RNA的方法，所述规模化合成长链RNA的方法包括：a、设计RNA短片段和夹板DNA片段：根据目的RNA单链设计多个RNA短片段，以使多个所述RNA短片段能通过组合形成至少一条完整的目的RNA单链；根据所述RNA短片段设计夹板DNA片段；混合多个所述RNA短片段与所述夹板DNA片段，得到连接混合物；b、连接：向步骤a中的所述连接混合物中加入DNA连接酶和RNA连接酶，以通过DNA连接酶连接多个所述RNA短片段和多个夹板DNA片段，以及通过RNA连接酶连接所述RNA短片段和3'PolyA尾端，得到未加帽的长链RNA；c、加帽：向步骤b中的所述未加帽的长链RNA中加入加帽酶，以给未加帽的长链RNA的5'端加上帽子结构，得到加帽的长链RNA；d、去夹板DNA片段：向步骤c中的所述加帽的长链RNA中加入DNA酶，以去除所述加帽的长链RNA中连接的夹板DNA，得到所需的长链RNA。可选地，所述RNA短片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％；所述夹板DNA片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％。可选地，所述步骤a中所述连接混合物的RNA短片段与夹板DNA片段的摩尔浓度之比为8～10:11。可选地，所述加帽酶包括RNA三磷酸酶、RNA谷氨酸转移酶、鸟嘌呤-7-甲基转移酶或二氧基甲基化转移酶中的一种或其组合。可选地，所述步骤c中的所述帽子结构包括Cap0结构或Cap1结构。可选地，所述RNA短片段的长度为100～170nt；所述夹板DNA的长度为30bp～40bp。可选地，所述步骤d去夹板DNA片段：向步骤c中的所述加帽的长链RNA中加入DNA酶，以去除所述加帽的长链RNA中连接的夹板DNA，得到所需的长链RNA的步骤之后还包括：e、纯化：将步骤d中得到的长链RNA进行氯化锂/乙醇沉淀、离心柱、氯萃取/乙醇沉淀、凝胶纯化或高效液相色谱纯化中的至少一种，以获得纯化后的长链RNA；f、纯度检测：将步骤e中得到的纯化后的长链RNA进行琼脂糖或聚丙酰胺凝胶电泳、HPLC分析检测、内毒素残留检测、DNA残留检测以及蛋白残留检测中的至少一种。本专利技术还提供一种定点修饰长链RNA的方法，所述定点修饰长链RNA的方法包括：a1、设计合成如权利要求1至6任一项所述的规模化合成长链RNA的方法中的RNA短片段和夹板DNA片段，并对指定的RNA短片段进行定点化学修饰；b1、连接步骤a1中合成的RNA短片段、定点修饰后的RNA短片段及夹板DNA片段，以得到经过定点修饰的未加帽的长链RNA；c1、对上述步骤b1中得到的经过定点修饰的未加帽的长链RNA加帽，得到经过定点修饰的加帽的长链RNA；d1、去除步骤c1中得到的经过定点修饰的加帽的长链RNA中的夹板DNA，以得到所需的经过定点修饰的长链RNA；e1、对步骤d1中得到的经过定点修饰的长链RNA进行纯化和纯度检测。本专利技术技术方案先通过化学法合成大量夹板DNA片段和不同的RNA短片段(包括未经化学修饰的RNA短片段以及定点修饰后的RNA短片段)，然后通过生物法将不同RNA短片段连接起来以形成目的RNA长链。具体的，通过DNA连接酶实现不同RNA短片段与夹板DNA片段之间的连接，通过RNA连接酶实现RNA短片段与3'PolyA尾端的连接，通过加帽酶(所述加帽酶包括但不限于二氧基甲基化转移酶(2'-OMethyltransferase)或者RNA三磷酸酶(triphosphatase)、RNA谷氨酰转移酶(guanyltransferase)及鸟嘌呤-7-甲基转移酶(Guanine-7-methyltra本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述规模化合成长链RNA的方法包括：/na、设计RNA短片段和夹板DNA片段：根据目的RNA单链设计多个RNA短片段，以使多个所述RNA短片段能通过组合形成至少一条完整的目的RNA单链；根据所述RNA短片段设计夹板DNA片段；混合多个所述RNA短片段与所述夹板DNA片段，得到连接混合物；/nb、连接：向步骤a中的所述连接混合物中加入DNA连接酶和RNA连接酶，以通过DNA连接酶连接多个所述RNA短片段和多个夹板DNA片段，以及通过RNA连接酶连接所述RNA短片段和3'PolyA尾端，得到未加帽的长链RNA；/nc、加帽：向步骤b中的所述未加帽的长链RNA中加入加帽酶，以给未加帽的长链RNA的5'端加上帽子结构，得到加帽的长链RNA；/nd、去夹板DNA片段：向步骤c中的所述加帽的长链RNA中加入DNA酶，以去除所述加帽的长链RNA中连接的夹板DNA，得到所需的长链RNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述规模化合成长链RNA的方法包括：
a、设计RNA短片段和夹板DNA片段：根据目的RNA单链设计多个RNA短片段，以使多个所述RNA短片段能通过组合形成至少一条完整的目的RNA单链；根据所述RNA短片段设计夹板DNA片段；混合多个所述RNA短片段与所述夹板DNA片段，得到连接混合物；
b、连接：向步骤a中的所述连接混合物中加入DNA连接酶和RNA连接酶，以通过DNA连接酶连接多个所述RNA短片段和多个夹板DNA片段，以及通过RNA连接酶连接所述RNA短片段和3'PolyA尾端，得到未加帽的长链RNA；
c、加帽：向步骤b中的所述未加帽的长链RNA中加入加帽酶，以给未加帽的长链RNA的5'端加上帽子结构，得到加帽的长链RNA；
d、去夹板DNA片段：向步骤c中的所述加帽的长链RNA中加入DNA酶，以去除所述加帽的长链RNA中连接的夹板DNA，得到所需的长链RNA。


2.如权利要求1所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述RNA短片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％；所述夹板DNA片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％。


3.如权利要求1所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述步骤a中所述连接混合物的RNA短片段与夹板DNA片段的摩尔浓度之比为8～10:11。


4.如权利要求3所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述加帽酶包括RNA三磷酸酶、RNA谷氨酸转移酶、鸟嘌呤-7-甲基转移酶或二氧基甲基化转移酶中的一种或其组合。


5.如权利要求1至4任一项所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张苗苗，
申请(专利权)人：深圳市瑞吉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44