一种里氏木霉及其在木聚糖酶生产中的应用制造技术

本发明专利技术属于微生物改造筛选技术领域，具体涉及一种里氏木霉突变菌株及其在木聚糖酶生产中的应用。所述突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2018885。所述突变菌株摇瓶发酵120h后，其发酵上清液中木聚糖酶酶活达到1980 U/mL，较出发菌提高32%；20L罐发酵160h后，其发酵上清液中木聚糖酶酶活高达32050 U/mL，比出发菌提高了68%，取得了意料不到的技术效果。本发明专利技术提供的里氏木霉突变菌株可广泛应用于木聚糖酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进木聚糖酶的推广与应用。

Trichoderma reesei and its application in xylanase production

【技术实现步骤摘要】
一种里氏木霉及其在木聚糖酶生产中的应用
本专利技术属于微生物改造筛选
，具体涉及一种里氏木霉菌株及其在木聚糖酶生产中的应用。
技术介绍
木聚糖酶是指能降解β-1，4-木聚糖生产木糖的一类酶，该类酶可以降解细胞壁的主要成分—半纤维素。所以，该类酶在微生物降解植物细胞壁生成可以利用的营养物质的过程中起了非常重要的作用。木聚糖酶通常可以由真菌、细菌、酵母、海藻等分泌产生。商业化的木聚糖酶主要由丝状真菌发酵产生。目前木聚糖酶在饲料中的应用日趋成熟，广泛应用于畜禽的饲料中。我国能量饲料主要有玉米、麦类、谷物和糠麸等，阿拉伯木聚糖是这些日粮中的主要成分之一，且无法被家禽等单胃动物消化利用。以小麦为例，大约含有114g/kg的非淀粉质多糖(NSP)，这些非淀粉质多糖主要是阿拉伯木聚糖。大约有210g/kg的非淀粉质多糖(NSP)是可溶于水的。阿拉伯木聚糖在单胃动物中显示出了抗营养的效果。水溶性的阿拉伯木聚糖形成高黏度的液体，从而阻碍了消化酶和营养底物的接触，导致营养物质吸收受阻。不可溶性的非淀粉质多糖则从物理空间上阻碍了酶和营养底物的结合。在饲料中添加木聚糖酶等其他酶制剂，可以很好地提高饲料在动物体内的消化利用率。随着基因工程技术的不断发展，木聚糖酶基因可以在大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、丝状真菌表达系统中表达。例如，从嗜热裂孢菌克隆了XynA基因并在毕赤酵母X-33中表达，重组酶蛋白在pH6.0-9.0和60-80℃的环境中能维持60%的酶活性，由于其对pH和温度有较高的耐受性，使该酶具有较大的应用潜力。从芽孢杆菌中克隆到的木聚糖酶基因Xyn11A，该基因编码366个氨基酸，重组蛋白酶的最适反应温度为55℃。将黑曲霉IA-001的XynB基因进行优化，并克隆到毕赤酵母GS115中，优化后的重组蛋白比野生型酶活性提高了2.8倍，重组后的蛋白可以表达更高的木聚糖酶活。本专利技术通过诱变的方法筛选获得木聚糖酶酶活提高的生产菌株，以适应工业化的大规模生产，并促进木聚糖酶的进一步发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种里氏木霉（Trichodermareesei）菌株及其在木聚糖酶生产中的应用。申请人通过紫外诱变的方法筛选获得一株木聚糖酶产量大幅提高的突变菌株，可广泛应用于木聚糖酶的生产，降低该酶的成本，有利于木聚糖酶的广泛应用。本专利技术一方面提供了一种突变株里氏木霉SC-2F64（TrichodermareeseiSC-2F64），已于2018年12月12日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2018885。本专利技术一方面提供了所述里氏木霉在生产木聚糖酶中的应用。本专利技术还提供了一种生产木聚糖酶的方法，是以所述里氏木霉为发酵菌株。本专利技术还提供了一种木聚糖酶，是由所述里氏木霉发酵获得的。本专利技术以里氏木霉Mu17为出发菌株，通过紫外诱变方法筛选获得突变菌株里氏木霉SC-2F64。所述突变菌株摇瓶发酵120h后，其发酵上清液中木聚糖酶酶活达到1980U/mL，较出发菌提高32%；20L罐发酵160h后，其发酵上清液中木聚糖酶酶活高达32050U/mL，比出发菌提高了68%，取得了意料不到的技术效果。本专利技术提供的里氏木霉突变菌株可广泛应用于木聚糖酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进木聚糖酶的推广与应用。具体实施方式本专利技术用到了微生物改造筛选使用的常规技术和方法。本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。具体实施方式对本专利技术进行详细描述。实施例1里氏木霉Mu17的摇瓶发酵及酶活检测申请人通过将里氏木霉来源的木聚糖酶基因转化入里氏木霉宿主细胞中，构建得到重组表达木聚糖酶的里氏木霉工程菌株Mu（TrichodermareeseiMu）。为了提高里氏木霉Mu的木聚糖酶产量，申请人以该工程菌为出发菌，通过紫外诱变方法筛选获得一株突变菌里氏木霉Mu17（TrichodermareeseiMu17）。该突变菌的木聚糖酶产量比出发菌提高了80%。申请人已于2017年12月15日将所述突变里氏木霉Mu17（TrichodermareeseiMu17）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017797。（该部分内容在申请号为201711477714.1的中国专利中已详细描述）将里氏木霉Mu17接种到新鲜的PDA平板（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；琼脂粉1.5%），30℃培养7d。吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，接种50mlMM发酵培养基（1.5%葡萄糖，4%液糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH4)2SO4，0.09%MgSO4，2%KH2PO4，0.04%CaCl2，0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000），28℃培养120小时，离心获得发酵上清液。将发酵上清液进行木聚糖酶酶活力测定。结果显示，所述发酵上清液中木聚糖酶酶活为1500U/mL。酶活测定方法（1）木聚糖酶活单位的定义在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。（2）酶活测定方法取2ml浓度为1%的木聚糖底物（pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制），加入到比色管中，37℃平衡10min，再加入2ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入5mlDNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值AE。酶活计算公式：XD=[(AE－AB)×K+C0]×N×1000/(M×t)式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol=1000μmol。实施例2紫外诱变筛选紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。申请人以里氏木霉Mu17为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其木聚糖酶的产量。2.1确定致死率将上述里氏木霉Mu17接种于PDA平板，30℃培养7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种里氏木霉，其特征在于，所述的里氏木霉的保藏编号为CCTCC NO:M2018885。/n

【技术特征摘要】
1.一种里氏木霉，其特征在于，所述的里氏木霉的保藏编号为CCTCCNO:M2018885。


2.权利要求1所述的里氏木霉在生产木聚糖酶中的应用。


3.一种生产木聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘士成，王贵斌，李松，钟源，王勐蕾，李瑞，黄亦钧，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37