一种具有生物诱导成矿作用的嗜酸真菌的分离与鉴定方法技术

本发明专利技术提供一种具有生物诱导成矿作用的嗜酸真菌的分离与鉴定方法，包括以下步骤：S1从铅锌矿尾矿酸性底泥中获得纯培养的嗜酸真菌，鉴定其菌落形态并确定菌种的分类学地位；S2以铅锌矿尾矿酸性废水作为培养液培养嗜酸真菌，分析嗜酸真菌在酸性环境中的代谢潜能。采用本发明专利技术的分离鉴定方法可以有效的分离鉴定从出铅锌矿尾矿酸性底泥分离出的嗜酸真菌的诱导成矿能力。

Isolation and identification of an acidophilic fungus with bioinduced mineralization

【技术实现步骤摘要】
一种具有生物诱导成矿作用的嗜酸真菌的分离与鉴定方法
本专利技术属于微生物分离
，具体涉及一种具有生物诱导成矿作用的嗜酸真菌的分离与鉴定方法。
技术介绍
矿山酸性环境主要包括矿山酸性废水(acidminedrainage,AMD)、底泥(sediment)和生物膜(biofilm)等，是在人类的采矿等生产活动中产生的。采矿活动产生的大量不可利用的残渣，即尾矿(tailings)，以及含矿物成分比较低的矿石(贫矿)等，往往被露天堆积存放，或者通过表层覆土(或者淹水)来进行处理；于是通过自发的或者是微生物介导的化学过程，则有可能形成多种多样的矿山酸性环境。AMD主要是由黄铁矿(pyrite，FeS2)和其它金属硫化物暴露在大气及水中氧化溶解后生成的。AMD及其相关环境具有极低的pH、高重金属浓度和高硫酸盐浓度的特征，对AMD环境中微生物的研究有利于我们揭示微生物在AMD产生过程中的作用，从而寻找合适的对策来抑制或减少AMD的产生。AMD环境中也存在一些可以提高pH值和固定重金属离子的有益微生物，对它们的研究和利用有助于我们开发AMD污染的生物修复和治理策略。矿山酸性环境作为极端环境的一种代表，其中的微生物群落具有较低的多样性，生物之间的相互关系相对简单，且它们在长期进化过程中逐渐形成了一些独特机制，以应对低pH值和高重金属含量等多种极端环境协迫。这样一个功能完善而又简单的微生物系统，被认为是研究微生物生态与进化的一个模式系统。通过揭示其中原核、真核微生物和病毒等的多样性和功能特征，有助于我们从整体上了解群落的各个组成部分的(协同)进化历史以及它们之间的相互作用。另外，AMD环境跟地球形成早期的条件极为相似，可以帮助我们了解生命早期的行为方式。因此，矿山酸性环境研究具有重要的理论研究价值。虽然面临多种环境胁迫，但与其他生境的微生物群落一样，矿山酸性环境中有不同功能类群的微生物，它们不仅驱动主要的生物地球化学循环过程，而且生物多样性对AMD生态系统的功能和稳定性至关重要。在过去的几十年中，基于微生物分离培养、SSUrRNA/ITS分子标记基因测序和宏基因组分析等技术，我们对矿山酸性环境中的微生物种类和多样性有了较深刻的认识。但其中相比于细菌和古菌原核生物的研究，关于真菌的研究则很少。同原核生物一样，矿山酸性环境中真菌数量很多，但是种类很少。矿山酸性环境中获得真菌纯培养最多的研究案例是研究者在美国俄亥俄州和弗吉尼亚州的AMD水体和附近的酸性土壤中分离到189种真菌，包括酵母型和丝状真菌。诸如假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、毛孢子菌属(Trichosporon)的真菌常常从AMD水体中分离到。通常来说，真菌可以适应很宽范围的pH(0-11)，在很多酸性环境比如火山口热泉、AMD或者工业污染的酸性废水中都有监测到其存在。但其中很多都是耐酸真菌，目前很少从酸性环境得到纯培养的嗜酸真菌。早在上世纪40年代Starkey和Waksman就从含有4％硫酸铜的水体中成功分离到两种极端嗜酸和耐重金属的真菌Scytalidiumacidophilium和Acontiumvelatum；前者甚至能在pH0的条件下生长。研究者后来从多地分离得到嗜酸真菌，比如邻近硫磺堆放场的土壤(pH1.4–3.5)中、酸性矿山废水(pH0.8–1.38)、富含腐殖酸和富里酸的褐煤(pH0.6)、酸性热泉等。2002年，AmaralZettler等利用18SrRNA基因克隆文库方法，首次研究了西班牙力拓河(RioTinto，pH2)的真核微生物群落，揭示了真核生物的多样性远高于原核生物，当中很多是未知类群，包括子囊菌门的代表和藻类、原生生物等。Baker等利用18SrRNA和β微管蛋白基因的克隆测序，分析了美国加州Richmond矿内极端酸性(pH0.8-1.38)、温度较高(30-50℃)、高金属含量的AMD水体中真核微生物的多样性，其中真菌主要属于子囊真菌的Dothideomycetes(座囊菌纲)和Eurotiomycetes(散囊菌纲)；并且这是第一次结合测序和原位荧光杂交技术(fluorescentinsituhybridization，FISH)两种技术来证明酸性环境中特定微生物类群的存在。随后，Baker等还报道了Richmond矿内AMD生物膜群落组成，系统发育分析揭示大部分(68％)的18SrDNA序列属于真菌。大多数真核生物谱系和嗜中性微生物接近，表明它们可能是近期适应了极端环境。分子分析证明AMD群落中真核物种数量很少，这和古菌、细菌的情况一致，揭示环境压力限制了所有营养级别的物种多样性。最近，Mesa等利用高通量16S/18SrRNA测序技术，研究了西班牙西南部一个废弃汞矿中AMD水体、底泥和生物膜等三种不同微环境中细菌、古菌和真核生物的多样性。虽然取得一些进展，但目前对AMD真核微生物的多样性及其生态分布格局的了解仍非常有限。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有生物诱导成矿作用的嗜酸真菌的分离与鉴定方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种具有生物诱导成矿作用的嗜酸真菌的分离与鉴定方法：S1从铅锌矿尾矿酸性底泥中获得纯培养的嗜酸真菌，鉴定其菌落形态并确定菌种的分类学地位；S2以铅锌矿尾矿酸性废水作为培养液培养嗜酸真菌，分析嗜酸真菌在酸性环境中的代谢潜能。进一步地，所述步骤S1获得纯培养的嗜酸真菌的具体步骤如下：在优化的9K平板培养基中涂布经稀释的铅锌矿尾矿酸性底泥，将平板置于25℃下培养1个月；挑取平板中的单菌落接种于9K液体培养基中获得纯培养物。进一步地，所述9K培养基的配制方法为：A、C液121℃灭菌20min，B液经0.2μm孔径滤膜过滤去除杂菌，然后将A、B、C液混合，即得9K培养基；其中所述A液配方为：(NH4)2SO43g，KCl0.1g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，Ca(NO3)2·H2O0.01g，蒸馏水500ml，pH为2.5；B液配方为：FeSO4·7H2O33g；蒸馏水300ml；pH为2.5；C液配方为：Agarose15g，蒸馏水200ml。进一步地，所述步骤S1确定菌种的分类学地位的具体步骤如下：提取嗜酸真菌的基因组DNA进行PCR扩增，对其全基因组测序，将获得的序列在NCBI上进行blast比对，获知与该序列同源性较高的已知序列，确定菌种的分类学地位。进一步地，所述PCR扩增使用的引物为ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。进一步地，所述步骤S2分析嗜酸真菌在酸性环境中的代谢潜能，具体包括以下步骤：在铅锌矿尾矿酸性废水添加葡萄糖液体，接种嗜酸真菌，培养后，检测培养沉淀物，对所述沉淀物进行元素分析。进一步地，所述元素分析具体是检测S、K、C、O、N、Fe、Ca元素。进一步地，所述元素分析采用X-射本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有生物诱导成矿作用的嗜酸真菌的分离与鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：/nS1从铅锌矿尾矿酸性底泥中获得纯培养的嗜酸真菌，鉴定其菌落形态并确定菌种的分类学地位；/nS2以铅锌矿尾矿酸性废水作为培养液培养嗜酸真菌，分析嗜酸真菌在酸性环境中的代谢潜能。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有生物诱导成矿作用的嗜酸真菌的分离与鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
S1从铅锌矿尾矿酸性底泥中获得纯培养的嗜酸真菌，鉴定其菌落形态并确定菌种的分类学地位；
S2以铅锌矿尾矿酸性废水作为培养液培养嗜酸真菌，分析嗜酸真菌在酸性环境中的代谢潜能。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1获得纯培养的嗜酸真菌的具体步骤如下：在优化的9K平板培养基中涂布经稀释的铅锌矿尾矿酸性底泥，将平板置于25℃下培养1个月；挑取平板中的单菌落接种于9K液体培养基中获得纯培养物。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述9K培养基的配制方法为：A、C液121℃灭菌20min，B液经0.2μm孔径滤膜过滤去除杂菌，然后将A、B、C液混合，即得9K培养基；其中所述A液配方为：(NH4)2SO43g，KCl0.1g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，Ca(NO3)2·H2O0.01g，蒸馏水500ml，pH为2.5；B液配方为：FeSO4·7H2O33g；蒸馏水300ml；pH为2.5；C液配方为：Agarose15g，蒸馏水200ml。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1确定菌种的分类学地位的具体步骤如下：提取嗜酸真菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧舒宁，江晓敏，梁洁良，贾璞，束文圣，李金天，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44