一种窖泥微生物分离方法技术

本发明专利技术属于微生物分离技术领域，公开了一种窖泥微生物分离方法，包括步骤①：以五点采样法采集窖泥；步骤②：称取10g窖泥样品，制备成窖泥悬浮液；步骤③：将窖泥悬浮液经过水浴后，接种于富集培养基中，将富集培养液采用梯度稀释涂布于分离培养基中，接种后的分离培养基置于厌氧罐内，分离培养，对各种不同特征的菌落进行平板划线纯化，获得单菌落；步骤④：将获得的单菌落划线分离，将分离的菌株进行己酸菌鉴定。采用酒糟浸液作为培养基可模拟微生物原生生长环境，使窖泥中的微生物能迅速适应新环境，缩短了微生物的活化时间，可提高微生物分离效率。

A method for microbial separation of pit mud

【技术实现步骤摘要】
一种窖泥微生物分离方法
本专利技术属于微生物分离
，特别涉及一种窖泥微生物分离方法。
技术介绍
生产浓香型酒，窖泥是基础，大曲是动力，工艺是关键。做浓香型优质酒，首先要抓好窖泥质量。窖泥的好坏直接决定着酒质的优劣。因为窖泥是己酸菌、甲烷菌、丁酸菌等各种有益物的载体和栖息场所，也是它的繁衍温床，这些有益微生物的种类和数量的多少是衡量窖泥质量的一个标准。浓香型大曲酒的主体香味物质是己酸乙酯，而己酸乙酯是由窖泥中梭状芽孢杆菌(己酸菌)等各种生香产酯微生物的代谢产物，所以没有好的窖泥，就不能生产上乘的浓香型优质酒，“百年老窖”出好酒也就是这个道理。用于窖泥养护的最重要产品是己酸菌以及可以产生丰富白酒风味物质的生香酵母产品，从窖泥中分离出这些微生物就可人工快速制作出新窖泥。目前通常采用80℃水浴加热的方法将对窖泥样品进行预处理，因为己酸菌的孢子具有耐热性，而其营养细胞是不耐热的，通过加热可以淘汰较弱的芽孢，并同时杀灭营养细胞和其他杂菌，但是窖泥中微生物种类繁多，耐热的孢子种类也较多，只采用水浴加热的方法筛选己酸菌难以将其他杂菌筛除干净，导致菌种的分离纯化过程需要对许多样品进行分离鉴定，操作繁琐，效率较低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种窖泥微生物分离方法，具有操作简单，菌种分离效率高，分离得到的己酸菌纯度高、活性高的效果。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：步骤①：以五点采样法采集窖池内的窖泥，将采集到的窖泥迅速放入厌氧袋中，置于冰上运输至实验室；<br>步骤②：称取窖泥样品，加入盛有无菌水及玻璃珠的三角瓶中，在回旋式振荡机中震荡，得到窖泥悬浮液；步骤③：将窖泥悬浮液经过水浴加热杀死营养体细胞，接种于富集培养基中，富集培养，将富集培养液采用梯度稀释涂布于分离培养基中，接种后的分离培养基置于厌氧罐内，分离培养，对各种不同特征的菌落进行平板划线纯化，获得单菌落；步骤④：将获得的单菌落划线分离纯化2～3次，斜面保存，将分离的菌株进行己酸菌鉴定，获得己酸菌。本专利技术的进一步设置为：步骤③中所述富集培养基为酒糟浸液培养基，所含组分按质量份计为：酒糟浸液1000份，黄土50～150份，酵母膏10～15份，NaAc3～5份，乙醇10～20份，MgSO4·7H2O0.1～0.3份，CaCO35～10份，聚谷氨酸10～30份、蔗糖酯5～15份。本专利技术的进一步设置为：所述酒糟浸液制备方法为：所述酒糟浸液制备方法为：取发酵车间窖底酒糟，用纯净水浸泡1～2h，然后用双层纱布过滤得到酒糟浸液。本专利技术的进一步设置为：所述步骤③所述分离培养基所含组分按质量份计为：所述步骤③所述分离培养基所含组分按质量份计为：水1000份，酵母膏2～4份，牛肉膏5～15份，蛋白胨5～15份，琼脂15～20份，可溶性淀粉1～3份，葡萄糖5份，半胱氨酸盐酸盐0.5份，NaCl1～5份，姜黄素2～6份，乙酸铜3～9份。本专利技术的进一步设置为：所述步骤③中，挑选产气早、气泡多的富集培养基，将所述富集培养基经过水浴加热处理后，经过梯度稀释涂布于分离培养基中。本专利技术的进一步设置为：所述步骤④中鉴定试验过程为：取己酸菌株液于试管中，加硫酸铜溶液，乙醚，振荡，静置使之反应分层，观察乙醚层呈现颜色，如呈现绿色，颜色越深，己酸产量越高，选择己酸产量高的菌株。本专利技术的进一步设置为：对所述乙酸含量高的菌株进行扩大培养后应用于人工窖泥的制作。本专利技术的有益效果是：1.采用酒糟浸液作为培养基可模拟微生物原生生长环境，使窖泥中的微生物能迅速适应新环境，缩短了微生物的活化时间，可使微生物在较短的时间内达到生长期，从而使微生物较快的富集，可提高微生物分离效率；2.在富集培养基中添加聚谷氨酸经微生物分解后产生的谷氨酸是微生物生长所必须的氨基酸，可加快微生物增殖速率，同时聚谷氨酸还可使富集培养基形成稳定的悬浊液，使黄土均匀分散在培养基中，微生物附着在黄土颗粒表面进行生长，避免了微生物聚集在一处争夺营养，可提高微生物增殖速率，蔗糖酯的加入可防止菌丝结球，避免多种微生物粘连，富集完成后的培养基中微生物分布均匀，微生物之间较为分散，在聚谷氨酸和蔗糖酯的协同作用下，富集培养基内能形成浓度较高且分散性较好的菌种，便于后续的菌种分离；3.分离培养基添加有半胱氨酸盐酸盐，有利于己酸菌的增殖，使己酸菌容易形成较好的菌落，提高了分离己酸菌的成功率，使窖泥中的多种己酸菌都能被筛选出来，分离培养基内还添加有姜黄素和乙酸铜，对大肠杆菌、绿脓杆菌等细菌起到抑制作用，避免杂菌对己酸菌产生干扰，有利于提高己酸菌分离效率。具体实施方式下面将对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1步骤①：以五点采样法采集湖北省古襄阳酒厂窖池内的窖泥，将采集到的窖泥迅速放入厌氧袋中，置于冰上运输至实验室；步骤②：称取10g窖泥样品，加入盛有无菌水及玻璃珠的三角瓶中，在回旋式振荡机中震荡，得到窖泥悬浮液；步骤③：将窖泥悬浮液经过80℃水浴10min加热杀死营养体细胞，接种于富集培养基中，所述富集培养基为酒糟浸液培养基，所含组分按质量份计为：酒糟浸液1000份，黄土50份，酵母膏10份，NaAc5份，乙醇10份，MgSO4·7H2O0.3份，CaCO35份，聚谷氨酸10份、蔗糖酯5份，37℃富集培养6d，挑选产气早、气泡多的富集培养基，将所述富集培养基经过水浴加热处理后，采用梯度稀释涂布于分离培养基中，分离培养基所含组分按质量份计为：水1000份，酵母膏2份，牛肉膏15份，蛋白胨5份，琼脂20份，可溶性淀粉1份，葡萄糖6份，半胱氨酸盐酸盐0.3份，姜黄素2份，NaCl5份，乙酸铜3份，接种后的分离培养基置于厌氧罐内，37℃培养3d，对各种不同特征的菌落进行平板划线纯化，获得单菌落；步骤④：将获得的单菌落划线分离纯化2～3次，斜面保存，将分离的菌株进行己酸菌鉴定，鉴定试验过程为：取己酸菌株液5mL于试管中，加2％硫酸铜溶液5mL，乙醚2mL，振荡，静置10min使之反应分层，观察乙醚层呈现颜色，如呈现绿色，颜色越深，己酸产量越高，选择己酸产量高的菌株。酒糟浸液制备方法为：取发酵车间窖底酒糟，用85℃的纯净水以1/4的料液比浸泡1h，然后用双层纱布过滤得到酒糟浸液。乙酸含量高的菌株进行扩大培养后应用于人工窖泥的制作。实施例2实施例2与实施例1不同之处在于：酒糟浸液培养基，所含组分按质量份计为：酒糟浸液1000份，黄土150份，酵母膏10份，NaAc3份，乙醇20份，MgSO4·7H2O0.1份，CaCO35份，聚谷氨酸20份、蔗糖酯10份，37℃富集培养4d。实施例3实施例3与实施例1不同之处在于：...

【技术保护点】
1.一种窖泥微生物分离方法，其特征在于：/n步骤①：以五点采样法采集窖池内的窖泥，将采集到的窖泥迅速放入厌氧袋中，置于冰上运输至实验室；/n步骤②：称取窖泥样品，加入盛有无菌水及玻璃珠的三角瓶中，在回旋式振荡机中震荡，得到窖泥悬浮液；/n步骤③：将窖泥悬浮液经过水浴加热杀死营养体细胞，接种于富集培养基中，富集培养，将富集培养液采用梯度稀释涂布于分离培养基中，接种后的分离培养基置于厌氧罐内，分离培养，对各种不同特征的菌落进行平板划线纯化，获得单菌落；/n步骤④：将获得的单菌落划线分离纯化2～3次，斜面保存，将分离的菌株进行己酸菌鉴定，获得己酸菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种窖泥微生物分离方法，其特征在于：
步骤①：以五点采样法采集窖池内的窖泥，将采集到的窖泥迅速放入厌氧袋中，置于冰上运输至实验室；
步骤②：称取窖泥样品，加入盛有无菌水及玻璃珠的三角瓶中，在回旋式振荡机中震荡，得到窖泥悬浮液；
步骤③：将窖泥悬浮液经过水浴加热杀死营养体细胞，接种于富集培养基中，富集培养，将富集培养液采用梯度稀释涂布于分离培养基中，接种后的分离培养基置于厌氧罐内，分离培养，对各种不同特征的菌落进行平板划线纯化，获得单菌落；
步骤④：将获得的单菌落划线分离纯化2～3次，斜面保存，将分离的菌株进行己酸菌鉴定，获得己酸菌。


2.根据权利要求1所述的一种窖泥微生物分离方法，其特征在于：步骤③中所述富集培养基为酒糟浸液培养基，所含组分按质量份计为：酒糟浸液1000份，黄土50～150份，酵母膏10～15份，NaAc3～5份，乙醇10～20份，MgSO4·7H2O0.1～0.3份，CaCO35～10份，聚谷氨酸10～30份、蔗糖酯5～15份。


3.根据权利要求2所述的一种窖泥微生物分离方法，其特征在于：所述酒糟浸液制...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘平，刘文汇，杨少勇，
申请(专利权)人：湖北古襄阳酒业有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42