一种野生阿魏菇菌种分离及其纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种野生阿魏菇菌种分离及其纯化方法，该方法采用野生种菇的挑选、制备分离纯化培养基及菌种分离纯化即可得到适合于本地气候特征的阿魏菇新菌株。本发明专利技术将马铃薯等组分进行综合配比，所获得的培养基能很好的达到分离出阿魏菇菌种的目的。本发明专利技术还采用组织分离法和孢子分离法，达到菌种分离纯化的目的。通过本发明专利技术所述两种分离方法获得的阿魏菇菌种在培养基上的菌落均为单一洁白菌落。相比现有技术，本发明专利技术具有专门针对野生阿魏菇菌种分离纯化设计的、易于操作、成本低、效率高的特点，丰富了现有阿魏菇的菌种资源。

Isolation and purification of wild Pleurotus ostreatus

【技术实现步骤摘要】
一种野生阿魏菇菌种分离及其纯化方法
本专利技术涉及野生食药用菌种分离方法领域，具体为一种野生阿魏菇菌种分离及其纯化方法。
技术介绍
阿魏菇(PleurotusFerulaeLenzi)又名阿魏侧耳，阿魏蘑，属真菌门，担子菌亚门，担子菌纲，伞菌目，口蘑科，侧耳属，是一种生于野生草药阿魏根茎上的珍稀食用菌，具有很高的食用和药用价值。每年五月生长，子实体单生，菌盖直径一般在10-20cm，色泽雪白，肉质细腻，因其生于阿魏植物上，它集食用、药用于一体，营养成份全面而且含量又高。宁丽等(莱阳农学院学报，2006，23(4)：309-311)等报道阿魏菇子实体干品中含蛋白质14.9％，脂肪4.31％，粗纤维15.4％，碳水化合物43.3％，真菌类多糖19％，17种氨基酸(总量为10.6％)，其中人体必需的8种氨基酸，占氨基酸总量的35％，比一般食用菌25％的水平要高。据氨基酸含量分析发现，其中赖氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸含量明显高于其它侧耳属品种，赖氨酸和精氨酸也比白灵菇高。阿魏菇除含有丰富的蛋白质、多糖、脂肪酸外，还含有丰富的维生素(主要含维生素D)、食用纤维，并富含钙、铁、锌、锰等多种矿质元素和微量元素。医学测试证明，阿魏菇葡聚糖等真菌多糖含量高达9％，能显著提高人体免疫力，选择性杀死机体内肿瘤细胞，对抗癌防癌有一定的作用。一些学者通过近几年的深入研究，先后报告了阿魏侧耳多糖具有抗炎、抗肿瘤、提高机体免疫力、抗衰老等功效。由于过度采摘和牲畜践踏，野生资源遭严重破坏，野生阿魏菇逐年减少。现在市面上的阿魏菇以人工培育为主。且野生阿魏菇仅产于特定季节、产量少、采摘困难。因此本方法能丰富阿魏菇的菌种资源，为大规模人工栽培提供菌种依据和参考。
技术实现思路
(一)专利技术目的：菌种分离技术是阿魏菇栽培的关键环节，为了保护我国珍贵的野生阿魏菇资源，保护生态环境，推动阿魏菇的商业化种植，降低种植风险和种植成本，本专利技术提供了一种专门针对阿魏菇菌种分离纯化设计的、操作简单、成功率高、成本低的阿魏菇菌种分离纯化方法。(二)技术方案为实现以上目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的一种野生阿魏菇菌种分离及其纯化方法，包括：1、野生种菇的挑选及消毒处理：种菇的主要标准是从不同地域、不同生长环境中采集多株菇型圆整、光滑直立、颜色洁白、柄粗盖厚、无病虫害、生长快而健壮的单生野生阿魏菇子实体备用；将采集的野生阿魏菇子实体在超净工作台无菌条件下，进行表面消毒，具体步骤是无菌水冲洗3次，升汞处理5分钟，然后8％次氯酸钠溶液消毒5分钟，再无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡5分钟，再无菌水冲洗3次；2、制备分离纯化培养基：各原料及其用量为：纯净水1000毫升，新鲜去皮马铃薯200g，小麦40g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，蛋白胨10g；3、菌种分离方法：(1)组织分离：在超净工作台上使用镊子在多株野生阿魏菇内部分别取出一块菌肉，然后将菌肉分别置于含链霉素的分离纯化培养基中央，将接种过的培养皿及试管置于不同的温度梯度(18℃，20℃，25℃)进行暗培养，每天观察并记录菌丝生长情况，定期统计菌丝培养特征，根据菌丝萌发及生长情况，确定最佳培养温度、相对湿度和培养时间；(2)孢子分离：在超净工作台内取消毒好的菌盖，用经火焰灭菌的接种环，沾上无菌水后，准确地直插在两片菌褶之间(切勿使接种环接触到裸露于空气间的菌褶部分，以免粘上杂菌)，轻轻地抹取，将尚未弹射的孢子沾在接种环上，取出接种环，在准备好的斜面培养基上或平板培养基上划线接种，加棉花塞或盖上平皿，将接种过的试管和培养皿置于不同的温度梯度(18℃，20℃，25℃)进行暗培养，每天观察并记录菌丝生长情况，定期统计菌丝培养特征，根据菌丝萌发及生长情况，确定最佳培养温度、相对湿度和培养时间；4、菌丝培养及纯化：在无菌条件下，将萌发的阿魏菇菌丝转接到新的培养基试管斜面及培养皿中，置于提前消毒处理过的培养箱内培养，温度保持20℃，相对湿度保持30-40％，培养3-5天；经恒温培养萌发后挑选几株发育匀称、生长快速的菌落，移接于另一试管斜面培养基上，如此重复操作三次，即可完成纯化，获得的阿魏菇纯菌丝体，即阿魏菇新菌种；5、所述步骤1中，对子实体的重量、肉质肥厚度、菌盖大小和柄长的数据进行记录，筛选出重量大、肉质肥厚度高、菌盖大和柄较长的子实体；6、所述步骤2中的特殊分离纯化培养基的配制方法为：各药品按实际用量计算后，按培养基配方逐一称取；将去皮马铃薯切成小块与小麦煮水过滤；把滤液放入锅中，依次加入葡萄糖、KH2PO4、MgSO4、蛋白胨，最后再加入琼脂粉，加热溶解；待琼脂完全溶解后再补水至所需量；按实验要求，将配制的培养基分装试管，封口；115℃灭菌30min后倾注斜面及培养皿备用；7、所述步骤3中，使用灭菌后的镊子在菌盖和菌柄交界出子实体内部取出菌肉，且菌肉呈黄豆粒大小。阿魏菇菌种孢子分离方法，采用菌褶涂抹法；8、所述步骤4中，根据菌丝萌发及生长情况，确定的野生阿魏菇菌种的最佳培养温度为20℃，相对湿度30-40％，培养时间为3-5天；(三)有益效果该野生阿魏菇菌种分离及其纯化方法，与现有技术相比，具有以下显著优点：本专利技术是专门针对野生阿魏菇菌种分离及纯化而设计的方法，选取不同地域的野生阿魏菇，通过配制特殊配方的分离纯化培养基，采用不同的菌种分离方法及不同的温度进行培养纯化，达到获得野生阿魏菇纯化菌种的目的，能够解决现有菌种数目少及容易遗传变异的问题。本专利技术操作简单，可利用此方法进一步获得更多的野生阿魏菇菌种资源。附图说明图1为野生阿魏菇子实体一图；图2为野生阿魏菇子实体二图；图3为野生阿魏菇菌丝体图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。以下所述实施例中所用的材料、试剂等，任何人均能从商业渠道采购。实施例1(1)种菇挑选及消毒处理：从不同地域、不同生长环境中采集多株菇型圆整光滑直立、颜色洁白、柄粗盖厚、无病虫害、生长快而健壮的单生野生阿魏菇子实体，并对每个子实体的重量、肉质肥厚度、菌盖大小和柄长的数据进行记录，筛选出重量大、肉质肥厚度高、菌盖大和柄较长的子实体(图1)；在超净工作台无菌条件下，进行表面消毒，具体步骤是无菌水冲洗3次，升汞处理5分钟，然后8％次氯酸钠溶液消毒5分钟，再无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡5分钟，再用无菌水冲洗3次，并沥干水分待用。(2)制备特殊的分离纯化培养基：各药品按实际用量计算后，按培养基配方逐一称取；新鲜去皮马铃薯200g，小麦40g，放入锅中，加1000mL蒸馏水，在加热器上加热至沸腾，维本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种野生阿魏菇菌种分离及其纯化方法，其特征在于：具体包括以下步骤：/n步骤一、野生种菇的挑选及消毒处理：种菇的主要标准是从不同地域、不同生长环境中采集多株菇型圆整、光滑直立、颜色洁白、柄粗盖厚、无病虫害、生长快而健壮的单生野生阿魏菇子实体备用；将采集的野生阿魏菇子实体在超净工作台无菌条件下，进行表面消毒，具体步骤是无菌水冲洗3次，升汞处理5分钟，然后8％次氯酸钠溶液消毒5分钟，再无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡5分钟，再无菌水冲洗3次；/n步骤二、制备分离纯化培养基：各原料及其用量为：纯净水1000毫升，新鲜去皮马铃薯200g，小麦40g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，KH

【技术特征摘要】
1.一种野生阿魏菇菌种分离及其纯化方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
步骤一、野生种菇的挑选及消毒处理：种菇的主要标准是从不同地域、不同生长环境中采集多株菇型圆整、光滑直立、颜色洁白、柄粗盖厚、无病虫害、生长快而健壮的单生野生阿魏菇子实体备用；将采集的野生阿魏菇子实体在超净工作台无菌条件下，进行表面消毒，具体步骤是无菌水冲洗3次，升汞处理5分钟，然后8％次氯酸钠溶液消毒5分钟，再无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡5分钟，再无菌水冲洗3次；
步骤二、制备分离纯化培养基：各原料及其用量为：纯净水1000毫升，新鲜去皮马铃薯200g，小麦40g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，蛋白胨10g；
步骤三、菌种分离方法：
(1)组织分离：在超净工作台上使用镊子在多株野生阿魏菇内部分别取出一块菌肉，然后将菌肉分别置于含链霉素的分离纯化培养基中央，将接种过的培养皿及试管置于不同的温度梯度(18℃，20℃，25℃)进行暗培养，每天观察并记录菌丝生长情况，定期统计菌丝培养特征，根据菌丝萌发及生长情况，确定最佳培养温度、相对湿度和培养时间；
(2)孢子分离：在超净工作台内取消毒好的菌盖，用经火焰灭菌的接种环，沾上无菌水后，准确地直插在两片菌褶之间(切勿使接种环接触到裸露于空气间的菌褶部分，以免粘上杂菌)，轻轻地抹取，将尚未弹射的孢子沾在接种环上，取出接种环，在准备好的斜面培养基上或平板培养基上划线接种，加棉花塞或盖上平皿，将接种过的试管和培养皿置于不同的温度梯度(18℃，20℃，25℃)进行暗培养，每天观察并记录菌丝生长情况，定期统计菌丝培养特征，根据菌丝萌发及生长情况，确定最佳培养温度、相对湿度和培养时间；
步骤四、菌丝培养及纯化：在无菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：木古丽·木哈西，
申请(专利权)人：伊犁师范大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65