一种提高灵芝细胞培养中灵芝酸含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高灵芝细胞培养中灵芝酸含量的方法；该方法是将双核的灵芝细胞通过原生质体单核化，将单核化的细胞作为初始菌种进行两阶段培养发酵，实现提高细胞中单体灵芝酸和总灵芝酸含量的目的；与双核菌株相比，本发明专利技术能够使灵芝细胞中的单体灵芝酸GA‑Mk、GA‑T、GA‑Me和总灵芝酸的含量分别提高2.4‑4倍，2‑2.6倍，1.7‑2.2倍和1.5倍，且本发明专利技术方法简单、易操作、具有广泛的应用前景。

A method of increasing the content of Ganoderma acid in Ganoderma cell culture

【技术实现步骤摘要】
一种提高灵芝细胞培养中灵芝酸含量的方法
本专利技术属于生物
，具体是一种通过对灵芝细胞进行单核化，然后经两阶段培养提高灵芝酸的方法。
技术介绍
灵芝又名仙草，是中国传统的药用真菌，是真菌界，担子菌亚门，层菌纲，多孔菌目，多孔菌科，灵芝属的高等真菌。灵芝具有抗癌，调节血糖，调节血压，保护肝脏，增强免疫力等作用。四环三萜类化合物灵芝酸是灵芝的主要活性成分之一，具有抗HIV、抗癌及抗氧化等药理活性。研究表明，不同的单体灵芝酸具有不同的生物学活性，例如：灵芝酸Mk可通过线粒体途径抑制HeLa细胞的增殖并诱导细胞调亡（LiuRM，etal.Phytomedicine,2011;18,349-355;TangW,etal.LifeSciences,2006;80,205-211）。灵芝酸T具有诱导肺癌细胞凋亡活性（TangW,etal.LifeSciences,2006;80,205-211）。而灵芝酸Me具有抑制肺癌细胞转移的活性（ChenNH,etal.JournalofPharmacologicalSciences,2008;108,212-216WangG,etal.InternationalImmunopharmacology,2007;7,864-870）。经检索发现，提高细胞内灵芝酸含量的方法主要分为以下几大类：一、发酵策略的开发，如中国专利技术申请CN1375557A公开了如下内容：生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方法，可以高效率生产灵芝酸，总灵芝酸含量达5mg/100mg细胞干重；二、培养过程中添加诱导剂，如中国专利技术专利CN101692772A中公开了一种在灵芝细胞的两阶段培养中添加苯巴比妥或咪康唑来提高灵芝酸含量的方法，此方法使单体灵芝酸的含量分别提高了32%-55%和10%-28%，总灵芝酸含量比对照提高了45%和15%。中国专利技术专利CN105483197B公开了一种通过添加钙离子和水杨酸提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法，此方法能够显著提高灵芝菌丝中三萜的含量，菌丝中三萜含量达4.89mg/100mg细胞干重，比对照组高48.26%。三、基因工程技术改造菌株，如中国专利技术专利CN105567578A公开了一种过表达SE基因提高灵芝细胞中灵芝酸含量的方法，使SE转化菌株的单体灵芝酸含量相较于对照提高了20%-150%。中国专利技术专利CN105296367B公开一种异源表达VGB基因提高灵芝酸含量的方法，VGB转化菌株的单体灵芝酸含量是对照的2.1-3.6倍。细胞单核化目前主要应用在灵芝的杂交育种方面；而通过单核化来提高两阶段培养中灵芝酸含量的方法尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种通过灵芝细胞单核化提高两阶段培养中灵芝酸含量的方法。本专利技术方法是将双核的灵芝细胞通过原生质体单核化，将单核化的细胞作为初始菌种，在25-30℃下进行两阶段培养发酵，实现提高灵芝酸含量的目的；通过本专利技术方法的实施，灵芝中单体灵芝酸含量和总灵芝酸含量均显著提高，与双核灵芝细胞相比，单核灵芝细胞的单体灵芝酸GA-Mk、GA-T、GA-Me的含量和总灵芝酸含量分别提高了2.4-4倍、2-2.6倍、1.7-2.2倍和1.5倍以上。本专利技术的方法的具体操作步骤如下：一、双核灵芝细胞种子液的制备1、配制土豆琼脂培养基2、灵芝细胞活化：利用接种铲从灵芝双核菌株斜面中取出两块1cm3的菌块，将菌块置于新配制的土豆琼脂培养基斜面上，培养5-7天待用。3、配制液体种子培养基利用接种铲将生长于土豆琼脂培养基斜面上的细胞接入含有直径5mm玻璃珠的液体种子培养基中，25-30℃下静置培养4-5天，获得一级种子培养液；将一级种子培养液，接入含有直径5mm玻璃珠的液体种子培养基中，25-30℃下静置培养2-3天，获得二级种子液。二、原生质体的制备与再生1、配制柠檬酸缓冲液2、在12000rpm下离心收集二级种子液细胞，然后用柠檬酸缓冲液将收集的细胞清洗两次，称重；3、根据细胞重量称取溶壁酶，按每200-300mg（湿重）细胞称取溶壁酶0.04g的比例，在称好的溶壁酶中添加柠檬酸缓冲液并定容，然后使用无菌的0.22μm滤膜过滤后加入装有细胞的离心管中，轻弹混匀；4、将混匀的细胞置于30℃、100rpm的摇床中，酶解150min，每隔30min颠倒摇晃一次；5、将酶解完毕的细胞在1700g下离心5min，弃上清，然后用柠檬酸缓冲液清洗残留物两次；清洗完毕后加入适量柠檬酸缓冲液，轻弹混匀，然后用520目的尼龙网过滤，除去碎菌丝；6、吸取100μL步骤5滤液，将其置于血球计数板上在显微镜下观察，计算原生质体个数；7、配制原生质体再生培养基(CYM)8、取1×104-1×105个原生质体加入到15mLCYM培养基中，然后将培养基倒入直径9cm培养皿中，于25-30℃下培养3-5天。三、单核化鉴定从25-30℃培养箱中取出平板，挑取单菌落接种于新鲜的土豆琼脂培养基斜面上，待其生长4-5天，再从斜面上取出一块置于倒有土豆琼脂培养基的培养皿上，并在离菌块1cm处斜插下玻璃片（经过灭菌），将培养皿放置于25-30℃中培养4-6天。1、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色鉴定将所得的带有菌丝的玻璃片放入0.1μg/mL的DAPI溶液中染色5min，然后用镊子夹出玻璃片，放入pH为7的0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗5min，置于倒置荧光显微镜下观察。2、SNP位点鉴定将所得的菌丝用接种铲刮下，利用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用引物MIP-F:ATGACACGGACCTCATAGCCT；MIP-R：ATGTCGCTCAGCCTGTCCAA，进行PCR扩增；然后回收PCR产物，测序。四、单双核灵芝两阶段培养1、配制发酵培养基2、将鉴定为单核和双核的灵芝分别接种于土豆培养基斜面上，25-30℃下培养5-7天；3、利用接种铲将生长于土豆培养基斜面上的细胞接入液体种子培养基中，25-30℃下振荡培养4-5天，获得发酵一级种子培养液；4、将一级种子培养液接入液体种子培养基中，25-30℃下振荡培养2-3天，获得二级种子液；5、将单核和双核的二级种子液分别接种到发酵培养基中，接种量是每50mL发酵培养基接种5mL二级种子培养液，进行两阶段培养；所述两阶段培养是将单核化的灵芝细胞接种到液体种子培养基中进行培养，获得种子液，将种子液接种于液体发酵培养基中，在25-30℃下振荡培养2-4天后，发酵液在25-30℃下继续静置培养8-10天。五、提取灵芝酸及测定灵芝酸含量。采用常规方法从发酵产物中提取收集灵芝酸并进行单体灵芝酸含量的测定（方法参照XuJW,etal.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2010:85,941-94本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高灵芝细胞培养中灵芝酸含量的方法，其特征在于：将双核的灵芝细胞通过原生质体单核化，将单核化的细胞作为初始菌种进行两阶段培养发酵，实现提高灵芝酸含量的目的。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高灵芝细胞培养中灵芝酸含量的方法，其特征在于：将双核的灵芝细胞通过原生质体单核化，将单核化的细胞作为初始菌种进行两阶段培养发酵，实现提高灵芝酸含量的目的。


2.根据权利要求1所述的提高灵芝细胞培...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐军伟，孙彬，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53