一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺，包含液体发酵过程、固体发酵过程和干燥粉碎过程三个阶段，与现有技术相比，本发明专利技术采用低值固液培养基，通过优化培养基配方与发酵工艺，使其具有产孢量大、生产周期短成本低廉、所产孢子具有一定的环境耐逆性等优点，同时采用低温干燥工艺使所制备的孢子粉具有更高的存活率与更长的贮存周期，特别适用于玫烟色棒束孢气生孢子与菌丝混合体的大规模生产。

Fermentation of Corynespora rosea and preparation of spore powder

【技术实现步骤摘要】
一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺
本专利技术涉及微生物农药领域，尤其涉及一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺。
技术介绍
昆虫病原真菌作为一类昆虫病原微生物，在害虫生物防治中起着非常重要的作用，其中尤以真菌农药技术的应用效果最为显著。真菌农药具有寄主范围广、药效显著、对环境安全、防治害虫不产生抗药性等优点，具有广阔的应用前景。玫烟色棒束孢(Isariafumosorosea)是一种重要的丝孢类昆虫病原真菌，对粉虱、蚜虫、木虱等刺吸式口器害虫具有较高致病力。国外目前已有多种玫烟色棒束孢生防制剂产品面世，约占到所有真菌农药产品的6％左右。我国目前尚未有玫烟色棒束孢商品制剂登记上市。丝孢类虫生真菌侵染体的发酵大量生产是制备真菌生物农药的基础，虫生真菌发酵大量生产工艺主要有三种：液体发酵、固体发酵、液固双相发酵。虫生真菌主要的侵染体包括菌丝体、芽生孢子和分生孢子3种。分生孢子较菌丝体和芽生孢子对环境的抵抗力更强，因而被更多地被作为活性物应用于害虫防治。当前广泛应用的虫生真菌工业化生产工艺为液固双相发酵，即首先通过液体发酵获得大量虫生真菌的菌丝体和芽生孢子，再将其接种于固体基质上进行固体发酵，从而获得大量的分生孢子。2.与本专利技术最相似的现有技术实现方案及其缺点目前可见的玫烟色棒束孢发酵产孢方法中，一类为实验室条件下的小试级的单相发酵方法(如：“一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法201310392214.3”和“温室采集分离用玫烟色棒束抱分生孢子培养基及制备方法201710389324.2”)，其均不具有规模化应用前景。一类虽具备规模应用前景，但其存在发酵成本高、产孢量低、孢子耐逆性不高和发酵周期长等缺陷(如：一种玫烟色棒束孢的发酵培养方法201611096775.9)。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺，其具有工艺简单、产孢量大、生产周期短成本低廉、制得的孢子具有一定的环境耐逆性和萌发率高和贮存期长等特点，是一种适合规模条件下大量培养具有规模应用前景的玫烟色棒束孢气生孢子与菌丝混合体的新方法。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：本专利技术提供的制备工艺通过以下技术方案实现：(1)本制备工艺包含液体发酵过程、固体发酵过程和干燥粉碎过程三个阶段，其中液体发酵为生产接种液阶段，固体发酵为发酵产孢阶段，干燥粉碎为制备孢子粉阶段。(2)液体发酵过程包括以下几个步骤：1)初始接种液菌种活化后接种于PDA培养基中培养7-10天产孢后用0.1％吐温80无菌水刮洗孢子并过滤制成孢子，以血球计数板调整孢子浓度至107个孢子/ml，形成初始接种液。2)液体培养基制备取普通大米以粉碎机粉碎，过120-200目筛(优选200目筛)制成大米粉。取一定量过筛后的大米粉与去离子水混合，配制能浓度为30-50g/L(优选50g/L)大米浆；同时在米浆中加入1％-1.5％的磷酸二氢钾(分子式：KH2PO4)(优选1.2％)、0.1％-0.3％的氯化钙(分子式：CaCl2)(优选0.2％)、0.1％-0.3％的硫酸锰(分子式：MnSO4)(优选0.1％)。3)液体发酵在灭菌后的液体培养基中接入5％的初始接种液，在温度为25℃-30℃(优选30℃)下、转速为150rpm-200rpm(优选180rpm)下培养3天。4)制备接种液以多层啥灭菌纱布过滤产孢后的发酵液，滤除菌丝与培养基杂质，以无菌水稀释至浓度为107孢子/ml，形成接种液。(3)固体发酵阶段包括以下几个步骤：1)固体培养基制备取500g大米加入等量去离子水浸泡10-12小时，之后沥干水分灭菌备用，灭菌条件为121℃、30min。配制浓度为0.1％维生素B2溶液和1％精氨酸溶液并灭菌，在灭菌后的大米培养基中分别加入5-10质量份维生素B2溶液和5质量份精氨酸溶液，混合均匀后平铺于灭菌后的托盘中。2)接菌与发酵产孢使用灭菌后的喷雾器将接种液均匀喷洒在制备好的培养基上，用保鲜膜覆盖托盘，放置于25℃培养箱培养7-10天。(4)干燥与粉碎阶段包括以下几个步骤：产孢完成后，将培养基托盘揭去保鲜膜，置于低温气流干燥箱中干燥，干燥条件为5-15℃，直至物料水分含量≤5％(w/w)。将干燥后的物料置于气流粉碎机粉碎，之后使用120目筛过筛制得孢子粉，以铝箔纸袋包装并真空密封。本专利技术的有益效果在于：本专利技术是一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺，与现有技术相比，本专利技术采用低值固液培养基，通过优化培养基配方与发酵工艺，使其具有产孢量大、生产周期短成本低廉、所产孢子具有一定的环境耐逆性等优点，同时采用低温干燥工艺使所制备的孢子粉具有更高的存活率与更长的贮存周期，特别适用于玫烟色棒束孢气生孢子与菌丝混合体的大规模生产。附图说明图1是不氨基酸对大米培养基发酵玫烟色棒束孢IF-1106产孢量的影响图；图2是不同维生素对大米培养基发酵玫烟色棒束孢IF-1106孢子耐热性的影响图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步说明：使用本专利技术工艺成本低且产孢量大，所生产的玫烟色棒束孢气生孢子具有存活率高、耐贮存和耐热性高等特点，所产孢子粉主要性能指标入下：表1本专利技术主要技术指标下面实验例用于进一步说明本专利技术，但不限于本专利技术。试验例一、液体发酵培养基的筛选试验以产孢量为评价指标筛选几种常见液体培养基，具体试验方法为：在250ml三角瓶中加入50ml液体培养基(试验液体培养基见表2)，灭菌后在无菌条件下按5％的接种量接入接种液，在25℃和150rpm的摇床培养72小时后镜检孢子数。表2试验液体培养基及其组成表3不同液体培养基的产孢量试验结果显示：不同的液体培养基产孢量差异较大，其中大米粉培养基的产孢量最大，且单位质量培养基产孢效率最高。试验例二、液体发酵培养基浓度条件试验以产孢量为评价指标筛选大米粉培养基浓度，具体试验方法为：取一定量(按质量体积浓度计算加入量)米糊溶解于一定量水中，加热煮沸后定容至30g/L,40g/L、50g/L(浓度＞50g/L培养基黏度太大，培养室通气条件变差)制成系列浓度的大米粉培养基，灭菌后在无菌条件下按5％的接种量接入接种液，在25℃和150rpm的摇床培养72小时后镜检孢子数。表4不同浓度大米粉培养基的产孢量试验结果显示：随着大米粉培养基浓度增大产孢量也在增大，当培养基浓度达到极限值50g/L时大米粉培养基具有最大的产孢量。试验例三、液体发酵接种量条件试验以产孢量为评价指标确定大米粉培养基发酵产孢的最佳接种量，具体试验方法为：在250ml三角瓶中加入50ml浓度为50g/L液体培养基，灭菌后在无菌条件下分别以1％，5％，10％，15％的接种量接入接种液，在25℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺，其特征在于：/n(1)包含液体发酵过程、固体发酵过程和干燥粉碎过程三个阶段，其中液体发酵为生产接种液阶段，固体发酵为发酵产孢阶段，干燥粉碎为制备孢子粉阶段；/n(2)液体发酵过程包括以下几个步骤：/n1)初始接种液：/n菌种活化后接种于PDA培养基中培养7-10天产孢后用0.1％吐温80无菌水刮洗孢子并过滤制成孢子，以血球计数板调整孢子浓度至10

【技术特征摘要】
1.一种玫烟色棒束孢发酵与孢子粉制备工艺，其特征在于：
(1)包含液体发酵过程、固体发酵过程和干燥粉碎过程三个阶段，其中液体发酵为生产接种液阶段，固体发酵为发酵产孢阶段，干燥粉碎为制备孢子粉阶段；
(2)液体发酵过程包括以下几个步骤：
1)初始接种液：
菌种活化后接种于PDA培养基中培养7-10天产孢后用0.1％吐温80无菌水刮洗孢子并过滤制成孢子，以血球计数板调整孢子浓度至107个孢子/ml，形成初始接种液；
2)液体培养基制备：
取普通大米以粉碎机粉碎，过120-200目筛制成大米粉；取一定量过筛后的大米粉与去离子水混合，配制能浓度为30-50g/L大米浆；同时在米浆中加入1％-1.5％的磷酸二氢钾(分子式：KH2PO4)、0.1％-0.3％的氯化钙(分子式：CaCl2)、0.1％-0.3％的硫酸锰(分子式：MnSO4)；
3)液体发酵：
在灭菌后的液体培养基中接入5％的初始接种液，在温度为25℃-30℃下、转速为150rpm-200rpm下培养3天；
4)制备接种液：
以多层啥灭菌纱布过滤产孢后的发酵液，滤除菌丝与培养基杂质，以无菌水稀释至浓度为107孢子/ml，形成接种液；
(3)固体发酵阶段包括以下几个步骤：
1)固体培养基制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁红亮，马瑞燕，王迪，王从林，相会明，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西;14