植物内生真菌菌种、菌株及其分离和应用方法技术

本发明专利技术属于微生物制备技术领域，具体涉及一种植物内生菌群及其分离纯化方法。该植物内生菌群至少由(Parengyodontium SP.)MD313901和(Purpureocillium SP.)MD313902两种植物内生菌珠组成。该植物内生菌群来自于天然植物药材，其两种菌株可以来自于同一植物药材，也可能来自不同植物药材。该植物内生菌群的制备方法包括植物组织预处理、植物组织内生菌浸出、植物组织内生菌分离、纯化。

Endophytic fungi and their isolation and Application

【技术实现步骤摘要】
植物内生真菌菌种、菌株及其分离和应用方法
本专利技术涉及微生物制备
，具体涉及一种微生物菌群的制备方法。
技术介绍
植物内生菌(Endophyte)是在一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的一大类微生物，他们能与植物形成寄生、共生、腐生等关系。研究发现，不仅从各种植物中可以分离得到内生菌，而且在同一种植物的根、茎、叶、花、果实和种子等中均有内生菌被发现。内生菌数量庞大，种类众多，包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌等。植物内生菌具有丰富的生物多样性，对于一种植物而言，从中可分离到的内生真菌或细菌通常为几种至几十种，有的甚至可达几百种。植物内生菌也是一种具有潜在应用价值的新的微生物资源，从植物内生菌中寻找新的生物活性物质成为研究的热点。
技术实现思路
本专利技术第一目的在于，提供一种植物内生真菌(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株。本专利技术第二目的在于，提供一种植物内生真菌(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株。本专利技术第三目的在于，提供一种包含(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株的植物内生菌群。本专利技术第四目的在于，提供一种包含(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和/或(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株的菌剂。本专利技术第五目的在于，提供本专利技术所述的植物内生真菌、植物内生菌群的分离方法。本专利技术第六目的在于，提供本专利技术所述的植物内生真菌、植物内生菌群的应用方法。一种植物内生真菌(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株(本专利技术也简称为MD313901)，其保藏号为CCTCCM2018256。本专利技术提供了一种全新的菌株，其属于内生真菌，命名为(ParengyodontiumSP.)MD313901，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地点为武汉，保藏时间为2018年5月8日；保藏号为CCTCCM2018256。此外，本专利技术还提供了另一全新的菌株，为植物内生真菌(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株(本专利技术也简称为MD313902)，其保藏号为CCTCCM2018257。本专利技术提供的全新的内生菌株MD313902，属于内生真菌，命名为(PurpureocilliumSP.)MD313902，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地点为武汉，保藏时间为2018年5月8日；保藏号为CCTCCM2018257。本专利技术所述的MD313901、MD313902，具有相类似的功能，均能通过该菌株的发酵，可以显著促进天然药材的多糖成分或者是糖蛋白成分的提取，提升多糖提取率。本专利技术还提供了一种植物内生菌群，包含(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株。本专利技术创新地研究发现，本专利技术所述的(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株可以出人意料地提升天然药材发酵的多糖或糖蛋白提取率。此外，本专利技术人还研究发现，MD313901菌株、MD313902具有良好的协同性，可以进一步提升天然药材的多糖成分或者是糖蛋白成分的提取率。本专利技术还提供了一种植物内生菌菌剂，包括(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和/或(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株，还包括其(菌株)耐于存活的辅料。本专利技术还提供了一种(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和/或(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株的分离方法，包括植物组织预处理、浸出、分离、纯化：操作过程如下：(1)植物组织预处理植物组织经切段、乙醇溶液浸泡、次氯酸钠溶液浸泡后无菌水洗涤，得预处理植物组织；(2)植物组织内生菌浸出将预处理植物组织和生物酶研磨，分离出研磨液中的上清液；(3)植物内生菌株的分离、纯化将上清液涂布在培养基上，培养后挑选出所述的菌株或菌群。本专利技术研究发现，通过该方法，可以有效分离出目的菌株或者菌群。作为优选，本专利技术所述的植物组织为天然植物药材。所述的植物组织至少含有所述菌群中至少一种菌种。作为优选，所述的植物组织为玉竹、黄芪、沙棘、马齿苋、黄精、桔梗、山豆根、板蓝根、商陆、鱼腥草、延胡索、半夏、牛蒡根、桔梗、蒲公英、甘草、白芍、石斛、当归、石菖蒲中的至少一种。步骤(1)中，植物组织用水冲洗干净后再用无菌水洗涤，晾干表面水分后将其切段，长度0.5-2.0cm，然后把切好的材料置于体积浓度70-80％乙醇消毒1-2min，无菌水清洗，再用质量浓度3-8％次氯酸钠浸泡5-10min，后用无菌水冲洗，晾干表面水分，即为预处理植物组织。步骤(2)中，将预处理植物组织置于消毒过的研钵或研磨机中，加入生物酶进行研磨，研磨液转入锥形瓶中25-40℃条件下100-200rpm振荡1-2小时，分离得上清液和植物残渣。作为优选，生物酶为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶中的一种或多种。作为优选，生物酶用量为药材(植物组织)重量的0.01％-5％。步骤(3)中，在无菌条件下将浸出过程所得的上清液用无菌水稀释10-20倍，分别取100-200μL涂布于MS培养基上进行培养，培养一段时间形成菌落后，挑选不同形态的菌落，真菌至PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基培养，细菌至牛肉膏蛋白胨培养基培养。步骤(3)中，对分离得到的真菌采用划线法纯化。本专利技术所述的分离方法先通过消毒有效避免混入杂菌影响内生菌的分离效果，整个分离过程严格控制环境无菌，避免操作过程中带来外来杂菌。本专利技术所述植物内生菌群在不同产地、不同品种的同一药材中用同样制备方法提取均有分布。本专利技术还提供了一种(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和/或(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株的应用，将其用于植物组织的发酵，用于提升植物组织多糖提取率。本专利技术研究发现，采用本专利技术MD313901菌株和/或MD313902菌株对天然植物进行发酵，可以显著提升天然植物的总多糖、糖蛋白的提取率。作为优选，所述的应用，将植物组织经酶解处理后再经所述(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和/或(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株的发酵，用于提取植物组织多糖。本专利技术方法，可将植物组织中的多糖以外的某些成分进一步转化成多糖，从而，进一步提高发酵液中的多糖的含量，提高多糖的提取率。有益效果本专利技术提供了全新的(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和(Pu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物内生真菌(Parengyodontium SP.)MD313901菌株，其特征在于，其保藏号为CCTCC M 2018256。/n

【技术特征摘要】
1.一种植物内生真菌(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株，其特征在于，其保藏号为CCTCCM2018256。


2.一种植物内生真菌(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株，其特征在于，其保藏号为CCTCCM2018257。


3.一种植物内生菌群，其特征在于，包含(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株。


4.一种植物内生菌菌剂，其特征在于，包括(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和/或(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株，还包括其耐于存活的辅料。


5.一种(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和/或(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株的分离方法，其特征在于，包括植物组织预处理、植物组织内生菌浸出、植物内生菌的分离、纯化：操作过程如下：
(1)植物组织预处理
植物组织经切段、乙醇溶液浸泡、次氯酸钠溶液浸泡后无菌水洗涤，得预处理植物组织；
(2)植物组织内生菌浸出
将预处理植物组织和微生物酶研磨，分离出研磨液中的上清液；
(3)植物内生菌株的分离、纯化
将上清液涂布在培养基上，培养后挑选、纯化出所述菌株或菌群。


6.如权利要求5所述的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，植物组织用水冲洗干净后再用无菌水洗涤，晾干表面水分后将其切段，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓忠，夏文娟，伍惠，李洋，
申请(专利权)人：湖南湘源美东医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43