本发明专利技术涉及一种中国被毛孢原生质体制备与再生方法，所述方法是通过以氯化钾溶液为渗透压稳定剂，以商品酶Driselase from Basidiomycetes sp，Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和Yatalase作为复合酶进行酶解，能够制备得到含量高的中国被毛孢原生质体并成功再生，同时通过优化再生培养基实现原生质体再生时间的缩短，且操作简单，便于推广实施，具有较好应用前景。
Preparation and regeneration of protoplast of trichospora sinensis
【技术实现步骤摘要】
一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法(一)
本专利技术涉及一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法。(二)
技术介绍
冬虫夏草(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)简称虫草，是子囊菌门(Ascomycota)，核菌纲(Pyrenomycetes)，麦角菌目(Clavicipitales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps)的一种真菌。虫草菌通过侵染鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫的幼虫，以其体内的有机物质作为营养和能量的来源进行寄生生活，经过不断生长发育和分化后，最终菌丝体扭结并形成伸出寄主外壳的子座，与幼虫尸体形成复合体，从而构成了冬虫夏草。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。经过多年争论，2005年10月，中国菌物学会在北京召开了《冬虫夏草及其无性型研讨会》，确定中国被毛孢(Hirsutellasinensis)为冬虫夏草唯一无性型菌种。中国被毛孢人工发酵培养得到的菌丝经药理学和毒理学等研究，均证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，可替代天然虫草生产虫草制品，以弥补自然资源的短缺。现今中国被毛孢已经可以成功培育，但产量不高，其中一个制约因素是中国被毛孢生长条件苛刻，是一种生长缓慢周期长的低温菌，极大的限制了人工培育的发展。因此，对中国被毛孢进行内部研究和改造势在必行，而构建一套完整高效的中国被毛孢原生质体制备与再生体系不仅可以为菌株诱变筛选和原生质体融合的实现提供条件，还可以为中国被毛孢转化体系的构建和组学的进一步研究提供基础。现有的技术中没有一整套完整高效的原生质体制备与再生体系，难以满足后续研究的需求。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是针对现有技术的不足，提供一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法。本专利技术采用的技术方案是：一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法，所述方法包括：(1)菌丝的培养与纯化：取中国被毛孢菌丝体，接种于种子培养基中，于11～26℃、60～200rpm转速下培养15～30天，再转接于发酵培养基中，于11～26℃、60～200rpm转速下培养3～12天，在离心机6000～10000rpm下用0.4～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤菌丝2～3次，收集得到纯化后的菌丝体；(2)原生质体的制备：向步骤(1)所得中国被毛孢菌丝体中加入复合酶液，于16～30℃、80～150rpm下酶解0.5～3h，过滤菌丝收集原生质体，在离心机3000～5000rpm下用0.6～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤原生质体2～3次，将原生质体重悬于0.6～1.0mol/L氯化钾溶液中；所述复合酶液为以0.4～1.0mol/L氯化钾溶液作为渗透压缓冲液，配制的DriselasefromBasidiomycetessp.,LysingEnzymefromTrichodermaharizianum和Yatalase分别为1000～2000U/L，5000～20000U/L和3000～10000U/L的混合溶液；其中DriselastfromBasidiomycetessp.为崩溃酶，是含有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、昆布多糖酶和木聚糖酶的混合商品酶，其酶解原理主要通过酶解细胞壁中的支撑骨架来释放细胞壁内的碳水化合物，从而实现细胞壁的裂解。Yatalase中含有几丁质酶、壳二聚糖和溶解酶，其主要通过酶解细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽从而达到裂解细胞壁的目的。LysingenzymefromTrichodermaHarzianum为溶壁酶，其中含有β-葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶，通过全面酶解细胞壁中的各个成分来实现真菌细胞壁的裂解，这几种商品酶近年来广泛用于真菌细胞壁的裂解。(3)原生质体的再生：将步骤(2)得到的原生质体涂布于再生培养基中，添加湿棉球于13～30℃下培养15～30天，得到再生中国被毛孢。渗透压稳定剂是维持新生原生质体形态和活性的重要载质，同时作为酶解液的溶剂影响着酶活力，本专利技术选用氯化钾溶液为渗透压稳定剂，可较好地维持酶解出的原生质体的完整性和活力。步骤(1)中种子培养基可为常规适用于中国被毛孢的种子培养基，优选组成如下：步骤(1)中发酵培养基可为常规适用于中国被毛孢的发酵培养基，优选组成如下：葡萄糖10～30g/L，酵母粉3～10g/L，糊精3～10g/L，蛋白胨5～20g/L，磷酸二氢钾0.05～2g/L，无水硫酸镁0.05～2g/L，溶剂为水。发酵培养基更优选组成为：葡萄糖15g/L，酵母粉5g/L，糊精5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，无水硫酸镁0.1g/L，余量为水。步骤(2)中复合酶液优选为以0.6mol/L氯化钾溶液作为渗透压缓冲液，配制的DriselasefromBasidiomycetessp.,LysingEnzymefromTrichodermaharizianum和Yatalase分别为1500U/L，15000U/L和8000U/L的混合溶液。步骤(3)中再生培养基组成如下：蚕蛹粉10～30g/L，麸皮10～25g/L，玉米粉10～25g/L，葡萄糖10～30g/L，酵母粉3～10g/L，蛋白胨5～20g/L，糊精3～10g/L，琼脂5～20g/L，甘露醇0.5～1mol/L，磷酸二氢钾0.05～2g/L，无水硫酸镁0.05～2g/L，溶剂为水。再生培养基更优选组成为：蚕蛹粉15g/L，麸皮15g/L，玉米粉10g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉5g/L，糊精5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15g/L，甘露醇0.6mol/L，磷酸二氢钾0.2g/L，无水硫酸镁0.1/Lg，余量为水。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了一种中国被毛孢原生质体的制备与再生方法，通过以氯化钾溶液为渗透压稳定剂，以商品酶DriselasefromBasidiomycetessp.，LysingEnzymefromTrichodermaharizianum和Yatalase作为复合酶进行酶解，能够制备得到含量高的中国被毛孢原生质体并成功再生，同时通过优化再生培养基实现原生质体再生时间的缩短，且操作简单，便于推广实施，具有较好应用前景。(四)附图说明图1为实施例制备的中国被毛孢原生质体镜检图；图2为实施例制备的中国被毛孢原生质体再生图；图3为酶解时间对中国被毛孢原生质体制备的影响；图4为酶解温度对中国被毛孢原生质体制备的影响；图5为不同再生培养基对原生质体再生率及再生时间的影响；图6不同培养基所含渗稳剂对原生质体再生率及再生时间的影响；图7不同最初涂布密度对原生质体再生率及再生时间的影响(五)具体实施方式下面本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法，所述方法包括：/n(1)菌丝的培养与纯化：取中国被毛孢菌丝体，接种于种子培养基中，于11～26℃、60～200rpm转速下培养15～30天，再转接于发酵培养基中，于11～26℃、60～200rpm转速下培养3～12天，在离心机6000～10000rpm下用0.4～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤菌丝2～3次，收集得到纯化后的菌丝体；/n(2)原生质体的制备：向步骤(1)所得中国被毛孢菌丝体中加入复合酶液，于16～30℃、80～150rpm下酶解0.5～3h，过滤菌丝收集原生质体，在离心机3000～5000rpm下用0.6～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤原生质体2～3次，将原生质体重悬于0.6～1.0mol/L氯化钾溶液中；所述复合酶液为以0.4～1.0mol/L氯化钾溶液作为渗透压缓冲液，配制的Driselasefrom Basidiomycetes sp.,Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和Yatalase分别为1000～2000U/L，5000～20000U/L和3000～10000U/L的混合溶液；/n(3)原生质体的再生：将步骤(2)得到的原生质体涂布于再生培养基中，添加湿棉球于13～30℃下培养15～30天，得到再生中国被毛孢。/n...
【技术特征摘要】
1.一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法，所述方法包括：
(1)菌丝的培养与纯化：取中国被毛孢菌丝体，接种于种子培养基中，于11～26℃、60～200rpm转速下培养15～30天，再转接于发酵培养基中，于11～26℃、60～200rpm转速下培养3～12天，在离心机6000～10000rpm下用0.4～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤菌丝2～3次，收集得到纯化后的菌丝体；
(2)原生质体的制备：向步骤(1)所得中国被毛孢菌丝体中加入复合酶液，于16～30℃、80～150rpm下酶解0.5～3h，过滤菌丝收集原生质体，在离心机3000～5000rpm下用0.6～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤原生质体2～3次，将原生质体重悬于0.6～1.0mol/L氯化钾溶液中；所述复合酶液为以0.4～1.0mol/L氯化钾溶液作为渗透压缓冲液，配制的DriselasefromBasidiomycetessp.,LysingEnzymefromTrichodermaharizianum和Yatalase分别为1000～2000U/L，5000～20000U/L和3000～10000U/L的混合溶液；
(3)原生质体的再生：将步骤(2)得到的原生质体涂布于再生培养基中，添加湿棉球于13～30℃下培养15～30天，得到再生中国被毛孢。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中种子...
【专利技术属性】
技术研发人员：金利群，柳志强，徐哲文，张博，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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