一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用，采用戊二醛将Tau截短蛋白和Tau磷酸化多肽共价偶联，形成重组磷酸化蛋白。本发明专利技术采用所述偶联方法制备重组pTau‑181、pTau‑231、pTau‑396磷酸化蛋白，并以此为磷酸化蛋白作为标准品定量检测样本中该磷酸化蛋白的含量。本发明专利技术提供的重组pTau‑181、pTau‑231、pTau‑396磷酸化蛋白，能够用于血液及脑脊液中pTau‑181、pTau‑231、pTau‑396磷酸化蛋白含量的检测，特异性强、灵敏度高，可用于阿尔茨海默症患者的辅助诊断、疗效评估及病程监控。

A covalent coupling method of phosphorylated peptide and truncated protein and its application

【技术实现步骤摘要】
一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用。
技术介绍
Tau蛋白是神经元细胞中众多微管相关蛋白（MAPs）之一，是一种低分子量含磷糖蛋白，它可以与神经轴突内的微管结合，并且具有诱导与促进微管蛋白聚合成微管、防止微管解聚和维持微管功能的稳定的作用。当Tau蛋白发生高度磷酸化、异常糖基化、异常糖化以及泛素蛋白化时，Tau蛋白失去对微管的稳定作用，导致神经纤维退化，从而引起神经功能失调。AD早期神经元纤维缠结（NFT）病理改变较轻，以Tau蛋白糖基化为主，而p-Tau蛋白含量较低，随着AD加重，以Tau蛋白的过度磷酸化为主，且由于血脑屏障被破坏，因此，AD患者血清中Tau磷酸化蛋白的含量会显著升高。目前磷酸化蛋白含量的检测主要通过质谱方法，其原因是现有的技术手段因缺少校准品即我们常说的抗原而不能满足我们采用免疫学方法进行定量检测蛋白磷酸化水平，常规合成的磷酸化多肽只有一个结合位点，无法满足我们对于两个结合位点蛋白的合成，本专利技术将磷酸化多肽和截短蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、将Tau截短蛋白和Tau磷酸化多肽溶解到磷酸盐缓冲液中并混匀，所述Tau截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述Tau磷酸化多肽为181磷酸化多肽、231磷酸化多肽或396磷酸化多肽；/nS2、在上述混合液中，加入戊二醛进行偶联反应；/nS3、偶联反应结束后，将上述反应液放入磷酸盐缓冲液中透析，再换用Tris-Hcl缓冲液透析，然后获得蛋白-磷酸化多肽偶联物，即形成重组磷酸化蛋白；/nS4、对上述偶联物进行浓度测定，最终用Tris-Hcl缓冲液进行保存。/n

【技术特征摘要】
1.一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将Tau截短蛋白和Tau磷酸化多肽溶解到磷酸盐缓冲液中并混匀，所述Tau截短蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，所述Tau磷酸化多肽为181磷酸化多肽、231磷酸化多肽或396磷酸化多肽；
S2、在上述混合液中，加入戊二醛进行偶联反应；
S3、偶联反应结束后，将上述反应液放入磷酸盐缓冲液中透析，再换用Tris-Hcl缓冲液透析，然后获得蛋白-磷酸化多肽偶联物，即形成重组磷酸化蛋白；
S4、对上述偶联物进行浓度测定，最终用Tris-Hcl缓冲液进行保存。


2.根据权利要求1所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，所述步骤S1中Tau截短蛋白和任一Tau磷酸化多肽的摩尔比为1︰5~10，所述步骤S2中选用20μl2.5%戊二醛，所述步骤S1和步骤S3中选用0.01MpH=7.2的磷酸盐缓冲液，所述步骤S3中选用0.05MpH=8.0Tris-Hcl缓冲液，所述步骤S4中选用含1%BSATris-Hcl缓冲液。


3.根据权利要求2所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，在将Tau截短蛋白和任一Tau磷酸化多肽溶解到磷酸盐缓冲液中并混匀之前还包括制备Tau截短蛋白，具体包括以下步骤：将Tau截短蛋白的核苷酸序列连接至表达载体，并装入表达菌株中；在培养基中过夜诱导Tau截短重组蛋白可溶性表达并纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳。


4.根据权利要求1-3所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，所述Tau磷酸化多肽为181磷酸化多肽，多肽序列如下所示：AKTPPAPKT（p）PPSSGEPPK，其序列如SEQIDNO:2所示，其中苏氨酸T位点添加有...

【专利技术属性】
技术研发人员：周小进，缪志刚，庄光磊，陈卓友，孙欢欢，
申请(专利权)人：苏州仁端生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32