一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽及其应用，属于生命科学技术领域，所述具有增强NK细胞杀伤活性的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述多肽与NK细胞孵育后，能够显著增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，提高NK细胞穿孔素和CD107a的表达量。

A peptide with enhanced NK cell killing activity and its application

【技术实现步骤摘要】
一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽及其应用
本专利技术属于生命科学
，尤其涉及一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤的发病率逐年提高，已成为全球致死率较高的疾病之一，曾被人们视为不治之症。其中，肿瘤的复发和转移是恶性肿瘤较难治愈的根源之一。究其根本，在于肿瘤细胞的免疫逃逸。自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞属于固有免疫细胞的一员，在肿瘤的免疫监视过程中发挥着极其重要的作用。NK细胞作为机体抗肿瘤及抗感染的第一道防线，在杀伤肿瘤细胞的过程中，不需要肿瘤特异性抗原的识别便可以直接发挥杀伤效应，故NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用比T淋巴细胞的作用要更直接、更迅速，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。NK细胞过继性免疫治疗是目前临床上肿瘤细胞免疫治疗的重要手段。由于外周血中NK细胞含量少(约占淋巴细胞的5％～10％)，体外扩增高效的NK细胞则成为NK细胞治疗的关键问题之一。NK细胞不是均质性群体，其膜表面分子在不同的NK细胞表面表达密度各不相同，而表达不同膜表面分子的NK细胞在分泌细胞因子和杀伤活性等方面亦有所不同。因此NK细胞在体外扩增过程中要考虑扩增的选择性。优化细胞因子组合能够诱导NK细胞向特定细胞毒性亚群扩增，如IL-2、IL-15和IL-21能够改变NK细胞特性，从而用于向特异的亚型发展。IL-2和IL-15能够诱导KIR-的NK细胞亚群表达KIR受体，诱导C凝集素受体NKG2D和自然杀伤毒性受体NKp44表达。而IL-21的加入能够改变KIR受体的组成，通过降低接头蛋白DAP-12的表达抑制NKp44的表达。IL-21能维持IFN-γ的产生，增强NK细胞毒性。Takahashi等(TakahashiE，KuranagaN，SatohK，etal.InductionofCD16+CD56brightNKcellswithantitumourcytotoxicitynotonlyfromCD16-CD56brightNKCellsbutalsofromCD16-CD56dimNKcells.ScandJImmunol，2007；65(2):126－138)考查了细胞因子对NK细胞亚型的影响，特别是对CD16-CD56dim和CD16-CD56brightNK细胞的影响。当IL-2、IL-12和IL-15对外周血单核细胞联合培养几天后，CD56brightNK细胞亚群能扩增到15％，对多种肿瘤细胞具有细胞毒性。细胞因子能够刺激在外周血中含量较少的CD16-CD56dim和CD16-CD56brightNK细胞大量扩增，而在外周血中含量较多的CD16+CD56dim扩增能力较弱。而且，很多静止的CD16-CD56brightNK细胞会诱导成CD16+CD56bright细胞，而CD16-CD56dimNK细胞在诱导成为CD16-CD56bright细胞，又进一步诱导为CD16+CD56bright细胞。CD16-CD56dim和CD16-CD56brightNK细胞能够产生大量的IFN-γ和Fas配体。CD16+CD56brightNK细胞对表达或不表达MHC-I类分子的肿瘤细胞均有很强的杀伤活性。IL-21与IL-2在维持人NK细胞存活的能力是相同的。在没有其他细胞因子的作用下，IL-21对NK细胞受体的表达几乎没有影响。然而，IL-21和IL-2协同可上调NK细胞表面多种受体的表达，包括NKG2A、CD25、CD86和CD69。CD25+CD86+NK细胞属于CD56brightNK细胞亚群，含有大颗粒。IL-21能在mRNA和蛋白水平上上调穿孔素和颗粒酶A/B的表达。另外，IL-21能增强NK细胞对K562靶细胞的毒性。以上研究表明IL-21通过诱导效应分子和调节表面受体表达来调节NK细胞活性。有研究发现，细胞因子IL-12、IL-15和IL-18能够激活NK细功能，然而共培养48h后，细胞发生明显凋亡。CD56+细胞用IL-15/IL-12或IL-15/IL-18孵育18h后，洗涤，进一步在无细胞因子培养基中培养，凋亡较少。这种短期激活的CD56+细胞对NK和LAK敏感的肿瘤靶细胞有很高的杀伤活性。每隔8d，就与细胞因子作用6h，共培养18d。这种重复的短期与细胞因子作用的培养方式够使CD56+细胞长期存活，同时CD16的表达降低较慢，因此与CD56+和细胞因子的长期孵育相比表现出较强的ADCC作用。环孢菌素A(CsA)一般用于防止移植物抗宿主反应(GVHD)。在含IL-2和IL-15的NK细胞培养基中加入或不加CsA1周后，与对照相比，CsA的加入使CD56+CD16+KIR+NK细胞减少，而相应的CD56+CD16-KIR-细胞增多。这种改变主要是CD56dimNK细胞扩增减少，而CSA对CD56bright细胞没有影响。同靶细胞K562共培养后，CSA作用的NK细胞Ca2+流动减少，NFAT去磷酸化。CsA增加NKp30的表达，降低NKp44和NKG2D的表达。随后IL-12和IL-18刺激后，CsA作用的NK细胞分泌更多的IFN-γ。因此CsA影响NK细胞的功能和表型，对GVL有重要作用。然而上述方法往往需要多种细胞因子联合应用才能起到诱导扩增NK细胞的目的，不仅增加了成本，同时临床不确定的危害无法评估，无法在工业上大规模生产。因此亟需开发能克服上述缺陷的NK细胞诱导扩增方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽及其应用；所述多肽与NK细胞孵育后，能够显著增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术提供了所述的多肽在制备增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性的药物中的应用。优选的，所述NK细胞为脐血来源的NK细胞。优选的，所述脐血来源的NK细胞为脐血单个核细胞经体外诱导分化获得。优选的，所述药物中多肽的使用浓度为20～30μmol/L。优选的，将所述药物与NK细胞混合孵育获得对肿瘤细胞杀伤活性增强的NK细胞。优选的，所述混合孵育的时间为6～18h。本专利技术提供了所述的多肽在制备提高NK细胞穿孔素的表达量的试剂中的应用。本专利技术提供了所述的多肽在制备提高NK细胞CD107a的表达量的试剂中的应用。本专利技术提供了所述的多肽在制备阻滞肿瘤细胞细胞周期的药物中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的具有增强NK细胞杀伤活性的多肽，能够显著增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，提高NK细胞穿孔素和CD107a的表达量；与所述多肽孵育后的NK细胞能够使肿瘤细胞的细胞周期阻滞，并促使肿瘤细胞凋亡。附图说明图1为本专利技术提供的多肽的质谱图；图2为NK细胞表型的流式细胞术检测结果，其中：A为培养前单个核细胞的流式细胞术检测结果，B为单个核细胞培养20d后的流式细胞术检测结果；C为NKp30本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.权利要求1所述的多肽在制备增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性的药物中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述NK细胞为脐血来源的NK细胞。


4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述脐血来源的NK细胞为脐血单个核细胞经体外诱导分化获得。


5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物中多肽的使用浓度为20～30μmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨兆勇，姬钰滢，金媛媛，陈静，邹森，樊帅，王忠博，石北辰，孙正阳，
申请(专利权)人：卓尔康北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11