一种双标签连接蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种双标签连接蛋白的制备方法，解决蛋白连接产物分子量不易控制且产物中两种蛋白比例不固定的问题，制备方法包括标签活化、淬灭EDC、标签与蛋白结合、蛋白相互连接、产物纯化及保存。本发明专利技术产物为寡聚物，分子量低；两种蛋白连接比例更加固定，主要产物为按照相同比例连接的两种蛋白；蛋白加标签后不与自身连接。

A preparation method of double labeled connexin

【技术实现步骤摘要】
一种双标签连接蛋白的制备方法
本专利技术涉及一种生物大分子的连接方法，可用于制备酶标蛋白，蛋白-蛋白连接物，蛋白-小分子标记等。
技术介绍
目前，常用的蛋白连接方法如图1所示，使用NHS/EDC连接蛋白方式。EDC是一种利用羧基与氨基实现相互交联的常用交联剂。EDC首先与羧基基团反应形成O-酰基异脲中间体，该中间体能与一个氨基基团迅速反应形成一个酰胺键并且释放一个异脲副产物；中间体在水溶液中是不稳定的，N-羟基琥珀酰亚胺可将中间体进行稳定化。未与氨基反应的中间体会水解生成羧基和N-取代尿素。常用的连接糖蛋白的方法还有高碘酸钠氧化法，常见的应用如抗体的HRP标记。HRP是一种糖蛋白，表面有6～8条糖链，高碘酸钠可将相邻的羟基氧化产生一个醛基，利用席夫碱反应，在碱性条件下醛基与氨基可生成碳氮双键，从而将两个蛋白连接在一起。如图2所示，此方法可以实现连接蛋白但是目的产物的成分较难控制，从图中可以看出连接产物的分子量远远大于抗体与HRP分子量之和，原料不断交联最终成为一种超级大分子。该方法并不是特例，目前常见的方法均可高效连接蛋白，但它们存在一个共同缺点是不易控制反应终点，蛋白除与另一种蛋白连接外还可以发生自身交联，交联的终点不容易控制，形成的产物分子量大且成分不固定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于得到两种蛋白1:1连接产物的双标签连接蛋白的制备方法，解决蛋白连接产物分子量不易控制且产物中两种蛋白比例不固定的问题。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种双标签连接蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、标签活化混合叠氮乙酸、EDC与NHS，EDC物质的量为叠氮乙酸的1.2～1.5倍，NHS物质的量为EDC的1.2～1.5倍，室温反应20分钟；混合丙炔酸、EDC与NHS，EDC物质的量为丙炔酸的1.2～1.5倍，NHS物质的量为EDC的1.2～1.5倍，室温反应20分钟；B、淬灭EDC加入β-巯基乙醇，β-巯基乙醇物质的量为EDC的1.2～1.5倍，室温反应30分钟；C、标签与蛋白结合叠氮乙酸组加入4.5倍总体积的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，与蛋白A混合，室温摇匀过夜；丙炔酸组加入4.5倍总体积的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，与蛋白B混合，室温摇匀过夜；D、蛋白相互连接混合两组溶液，抗坏血酸钠与硫酸铜混匀后加入体系，室温摇匀2天；硫酸铜用量为蛋白A/B物质的量的0.1％，抗坏血酸钠物质的量为硫酸铜的5～10倍；E、产物纯化根据下游反应需求，可使用HPLC等纯化技术对产物进行纯化；F、保存产物可根据需要选择分装后-80℃低温保存或冻干后低温保存。进一步地，步骤A，所述混合叠氮乙酸、混合丙炔酸、EDC与NHS均使用0.2mol/LPB(pH6.0)溶解。进一步地，步骤C，所述蛋白A和蛋白B均使用0.2mol/LPB(pH7.5)溶解。进一步地，所述EDC和抗坏血酸钠需要现配现用。进一步地，所述蛋白A和蛋白B分别为HRP和CRP。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：1.产物为寡聚物，分子量低；2.两种蛋白连接比例更加固定，主要产物为按照相同比例连接的两种蛋白；3.蛋白加标签后不与自身连接。附图说明图1为常用的蛋白连接方法线路图；图2为高碘酸钠氧化法用于抗体的HRP标记结果；图3为本专利技术双标签连接蛋白方法流程图；图4为HPR-CRP连接产物SDS-PAGE还原电泳图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明：本专利技术双标签连接蛋白的制备方法中，所述蛋白A和蛋白B以为HRP和CRP为例，但不局限于HRP和CRP，是一种普适的方法，适用于绝大多数蛋白。本实施例以HRP与CRP例，按照本专利技术提供的方法连接。A、配制试剂1％HRP：取HRP2mg加PBS(pH7.5)200μL使溶解；1mol/L叠氮乙酸：取叠氮乙酸74.86μL加PBS(pH6.0)925.13μL；1mol/L丙炔酸：取丙炔酸58.37μL加PBS(pH6.0)941.62μL；2mol/LNHS：取NHS434.26mg加PBS(pH6.0)1mL使溶解；1mol/LEDC：取EDC191.7mg加PBS(pH6.0)1mL使溶解；25mmol/L抗坏血酸钠：取抗坏血酸钠4.95mg加ddH2O1mL使溶解；5mmol/L硫酸铜：取五水硫酸铜12.4845mg加ddH2O10mL使溶解。PBS(pH＝6.0)：取NaH2PO48.77mL加Na2HPO41.23mL。PBS(pH＝7.5)：取NaH2PO41.60mL加Na2HPO48.40mL。B、结合EDC/NHS按下表混合样品，室温(25℃)反应20min；121mol/L叠氮乙酸10μL01mol/L丙炔酸010μL1mol/LEDC15μL15μL2mol/LNHS35μL35μL注：EDC现配现用C、淬火EDC按下表混合样品，室温(25℃)反应30min12β-巯基乙醇1.3μL1.3μLD、结合蛋白按下表混合样品，室温(25℃)反应过夜12HRP55μL0CRP(2.5mg/mL)045μL0.2MNa2HPO4269μL269μLE、蛋白连接每个样各取250μL混合，按下表混合样品，室温(25℃)反应3天1+225mmol/L抗坏血酸钠2.5μL5mmol/L硫酸铜2.5μL抗坏血酸钠与硫酸铜混合后再加入样品，抗坏血酸钠现配现用。F、产物保存分装后-80℃保存。CRP单个亚基分子量约24kDa，HRP分子量为44kDa。从HPR-CRP连接产物SDS-PAGE还原电泳图可以看出，加标签后的CRP分子量仍然为24kDa，没有与自身发生连接；同样HRP加标签后分子量仍然为44kDa，没有与自身发生连接；反应产物中除少量过量的HPR剩余外其余全部转化为目的产物，CRP被全部消耗，证明连接后的蛋白既包含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双标签连接蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nA、标签活化/n混合叠氮乙酸、EDC与NHS，EDC物质的量为叠氮乙酸的1.2～1.5倍，NHS物质的量为EDC的1.2～1.5倍，室温反应20分钟；/n混合丙炔酸、EDC与NHS，EDC物质的量为丙炔酸的1.2～1.5倍，NHS物质的量为EDC的1.2～1.5倍，室温反应20分钟；/nB、淬灭EDC/n加入β-巯基乙醇，β-巯基乙醇物质的量为EDC的1.2～1.5倍，室温反应30分钟；/nC、标签与蛋白结合/n叠氮乙酸组加入4.5倍总体积的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，与蛋白A混合，室温摇匀过夜；/n丙炔酸组加入4.5倍总体积的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，与蛋白B混合，室温摇匀过夜；/nD、蛋白相互连接/n混合两组溶液，抗坏血酸钠与硫酸铜混匀后加入体系，室温摇匀2天；/n硫酸铜用量为蛋白A/B物质的量的0.1％，抗坏血酸钠物质的量为硫酸铜的5～10倍；/nE、产物纯化/n根据下游反应需求，可使用HPLC等纯化技术对产物进行纯化；/nF、保存/n产物可根据需要选择分装后-80℃低温保存或冻干后低温保存。/n

【技术特征摘要】
1.一种双标签连接蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、标签活化
混合叠氮乙酸、EDC与NHS，EDC物质的量为叠氮乙酸的1.2～1.5倍，NHS物质的量为EDC的1.2～1.5倍，室温反应20分钟；
混合丙炔酸、EDC与NHS，EDC物质的量为丙炔酸的1.2～1.5倍，NHS物质的量为EDC的1.2～1.5倍，室温反应20分钟；
B、淬灭EDC
加入β-巯基乙醇，β-巯基乙醇物质的量为EDC的1.2～1.5倍，室温反应30分钟；
C、标签与蛋白结合
叠氮乙酸组加入4.5倍总体积的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，与蛋白A混合，室温摇匀过夜；
丙炔酸组加入4.5倍总体积的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，与蛋白B混合，室温摇匀过夜；
D、蛋白相互连接
混合两组溶液，抗坏血酸钠与硫酸铜混匀后加入体系，室温摇匀2天；
硫酸铜用量为蛋白A/B物质的量的0.1％，抗坏血酸钠物质的量为硫酸铜的5～10倍；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王旭东，焦虎平，李文亮，杨文魁，夏志平，游可为，陈浩源，
申请(专利权)人：润方长春生物科技有限公司，润方北京生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22