一种降钙素原突变体蛋白的原核重组表达及纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种降钙素原突变体蛋白的原核重组表达及纯化方法，包括重组降钙素原蛋白的基因克隆，重组PCT表达载体的构建，重组PCT表达菌的构建，重组PCT表达菌的诱导表达，以及重组PCT的分离纯化。通过分析PCT蛋白结构，对天然PCT蛋白序列进行了改造，对易降解位点进行了序列替换(利用‑Ala58‑Ala59‑和‑Ala92‑Ala93‑Ala94‑Ala95‑替换了‑Lys58‑Arg59‑和‑Gly92‑Lys93‑Lys94‑Arg95‑)，制备具有天然免疫原性的高纯度重组PCT蛋白，提高了PCT蛋白的稳定性，同时保持了原有的免疫原性；利用基因合成技术替代了原有的PCR技术制备目的基因，提高了基因操作的准确性和工作效率，缩短了表达菌构建的实验周期；设计了完整的蛋白表达纯化体系，得到的突变体蛋白可以作为标准抗原用于制备单克隆抗体，或作为标准品用于PCT的免疫学检测。

【技术实现步骤摘要】
一种降钙素原突变体蛋白的原核重组表达及纯化方法
本专利技术涉及一种降钙素原突变体蛋白的原核重组表达及纯化方法。
技术介绍
降钙素原蛋白(PCT)是一种含116个氨基酸残基的炎症相关蛋白，经体内水解酶水解可形成N端PCT(1-57aa)，降钙素(60-91aa)和降钙蛋白(96-116aa)三部分。这三部分有各自独立的免疫原性，现有的免疫学检测使用的单克隆抗体均是独立针对这三个多肽片段之一。在PCT的检测过程中要求使用的配对抗体分别针对其中两个多肽片段。PCT序列中的58-59aa(-Lys58-Arg59-)和92-95aa(-Gly92-Lys93-Lys94-Arg95-)作为多肽片段连接臂是水解位点，也是序列易降解部分。天然PCT本身易降解，稳定性差，现有技术无法有效改善PCT的稳定性。原核表达重组降钙素原蛋白的免疫原性和天然降钙素原蛋白可能是有差异的，不一定能准确检测体内降钙素原的表达水平。综上，PCT需要通过改变易降解位点序列提高稳定性，同时蛋白序列的变化不能引起免疫原性的改变。专利
技术实现思路
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【技术保护点】
1.一种降钙素原突变体蛋白的原核重组表达及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：/nA、重组降钙素原蛋白的基因克隆/n从NCBI上获取PCT的氨基酸序列，对天然PCT蛋白序列进行改造，对易降解位点进行序列替换，根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成重组PCT编码基因，N端加入pelBleader信号肽序列，以10个连续组氨酸序列作为纯化标签，并在首尾两端引入NdeI、XhoI酶切位点用于分子克；/n设计引物进行PCR反应用于鉴定合成基因，正向引物序列见SEQ ID NO：3，反向引物序列见SEQ ID NO：4，PCR条件如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种降钙素原突变体蛋白的原核重组表达及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、重组降钙素原蛋白的基因克隆
从NCBI上获取PCT的氨基酸序列，对天然PCT蛋白序列进行改造，对易降解位点进行序列替换，根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成重组PCT编码基因，N端加入pelBleader信号肽序列，以10个连续组氨酸序列作为纯化标签，并在首尾两端引入NdeI、XhoI酶切位点用于分子克；
设计引物进行PCR反应用于鉴定合成基因，正向引物序列见SEQIDNO：3，反向引物序列见SEQIDNO：4，PCR条件如下：



B、重组PCT表达载体的构建
将步骤A的合成基因和原核表达质粒pET26b(+)分别采用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，酶切条件为37℃，2h，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切片段进行回收，然后用T4连接酶将目的基因与表达载体pET26b(+)连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行阳性克隆PCR验证，PCR条件见步骤A，得到重组PCT的表达载体；
C、重组PCT表达菌的构建
将上述重组PCT的表达载体转入用于表达的大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组PCT表达菌；
D、重组PCT表达菌的诱导表达
将重组后的大肠杆菌BL21(DE3)接种于含有卡那霉素抗性...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍栋栋，刘淑香，杨文魁，焦虎平，曾丽亚，夏志平，游可为，陈浩源，
申请(专利权)人：润方长春生物科技有限公司，润方北京生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22